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前言
DNA甲基化在调节基因表达中起着重要作用,细胞DNA甲基化状态的变化与衰老,发育和疾病病理有关。这十多年来,Illumina为研究人员提供了由BeadArray TM技术驱动的基于微阵列的强大工具,以定量分析整个基因组的DNA甲基化。迄今为止,Infinium Human Methylation 450(450K) 和Methylation EPIC v1.0 BeadChips (850k)已被研究界用于推动表观基因组范围关联研究 (EWAS) 的数据收集。这些甲基化芯片在癌症研究、遗传疾病、衰老和分子流行病学领域中实现了基于甲基化的生物标志物的发现和应用。在此基础上,Illumina推出了新一代的升级版甲基化芯片Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip(935k) (图1,表1) ,建立在相同可靠的Infinium化学基础之上,更新优化了许多甲基化位点,以期在表观遗传学研究的新时代有更多的生物学发现。
EPICv2.0-935K芯片可检测人全基因组约935,000个CpG位点的甲基化状态,在EPICv1.0-850K的基础上去除了性能不佳的探针,新增186,000个CpG靶向增强子和超级增强子、更多CTCF结合位点、CNV检测区域、EPIC v1.0覆盖不足的CpG岛以及常见癌症驱动突变。此外,基因组版本更新到了HG38以及GenCode数据库使用的是v41版本,是更适合用于表观基因组全关联分析研究(EWAS)的一款芯片。
图1. Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip(935k)
表1. 产品基本信息
935k芯片相关特性
1. Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip芯片对全基因组的全覆盖
图2. 三种芯片位点比较—Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip建立在Infinium MethylationEPIC v1.0和HumanMethylation450 BeadChip的现有CpG主干之上
表2. 935k芯片探针的CpG岛覆盖情况
表3. 935k芯片探针的基因组区域覆盖情况
2. 两种芯片探针位点比较
935k芯片中保留的850k芯片探针位点:
CpG岛
人类干细胞中的非CpG甲基化位点(CHH位点)
ENCODE开放染色质和增强子
FANTOM5增强子
脱氧核糖核酸酶超敏位点
miRNA启动子区域
涵盖Infinium Methylation 450 BeadChip芯片中85%以上的位点
935k芯片中新增的探针位点:
在多种癌症的肿瘤样本与正常样本中鉴定的差异甲基化位点
通过ChIP-Seq在癌症和细胞系样品中鉴定的增强子和超级增强子
使用ATAC-Seq在原发性人类癌症中鉴定的差异可及染色质区域
扩大CpG岛的覆盖范围
增强外显子覆盖率,实现更准确的拷贝数变异 (CNV) 检测
常见癌症驱动突变
3. 芯片数据的可靠性
Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip沿用了在450K芯片中取得成功的Infinium I及II探针设计(Figure 4),以达到保证数据稳定可靠的同时也达到对目标区域全面覆盖。Infinium II探针对目的CpG位点采用单个探针且序列中包含简并碱基设计,即使序列中有多达三个CpG位点的甲基化状态影响也不会对目的位点的结果造成影响。Illumina的科学家严格检测每个产品,以确保强大而重复的性能,让研究人员能够实现行业领先的数据质量。
在InfiniumI设计中对于每个甲基化位点,都对应设计有两种探针:M型磁珠、U型磁珠。M型磁珠尾部为G,用来检测甲基化位点(C)。U型磁珠尾部为A,用来检测未甲基化位点(T)。根据单碱基延伸的原理,仅当探针最后一个碱基与模板配对时,荧光标记的核苷酸才能掺入并被检测到荧光信号。通过分析M型与U型磁珠荧光信号的结果计算甲基化值。
Infinium Ⅱ 探针只使用一种磁珠,探针末端为C,与目的位点的前一个碱基配对,只延伸一个碱基(ddNTP-BioT, ddNTP-DNP)分别与非甲基化或甲基化位点配对。根据两种荧光类型及计算目的位点的甲基化程度。
图3. 935k芯片显示出高再现性、向后兼容性以及与测序数据的相关性
4. 935K芯片同样适用于FFPE样品的甲基化研究
Illumina为FFPE样本的检测改进了protocol,以获得更可靠稳定的结果。通过与新鲜样本的比较,可见虽然FFPE样本的检出率受到样本质量的影响而下降,但FFPE样本的技术重复的相关性R2仍然高达0.98。
表4. 935K芯片用于FFPE样本时的技术重复相关性(R2≥0.98)及检出率(≥90%)
数据分析
分析流程
部分结果展示
标准化Beta值的Boxplot图
甲基化水平密度分布图
目前,晶能生物已经可以提供Illumina推出的新一代升级版甲基化芯片Infinium MethylationEPIC v2.0 BeadChip(935k)检测服务,欢迎各位老师前来咨询!
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