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上课笔记|小分子诱导聚合引发 BCL6 降解——提示新的治疗肿瘤的途径
发布日期:2021-08-13浏览:

 

 

 

文章概要

 

 

 

这篇文章, 题目是《Small molecule-induced polymerization triggers degradation of BCL6

 

文单发表在Nature杂志的202012月刊上。

 

文单的题目,翻译成中文,意思是《小分子诱导 BCL6 聚合并引发 BCL6 降解》

 

文章的通讯作者,是哈佛医学院的Benjamin L. Ebert教授。

 

研究背景

 

 

 

实验结果分析

 

实验内容的第一部分,BI-3802 诱导特定的 BCL6 降解

在科学家扫描BCL6的抑制剂的过程中,意外地发现了能导致BCL6蛋白降解的分子:BI-3802.

 

BI-3802的分子结构如图所示。

 

后面,会多次提到BI-3802这个化合物,为方便起见,后面我们会把这个化合物简称为B药。

 

另外,有一个与B药的化学结构很相近的化合物,BI-3812。这个BI-3812BCL6的抑制剂,但不是BCL6的降解剂。这与B药是有差别的

作者拿SuDHL4细胞系,用B药进行处理后,用质谱来看各个蛋白的变化,

 

BCL6是唯一的含量严重下降的蛋白。

这是,用B药处理前后,细胞质、细胞核、染色质中有的BCL6的含量的电泳图。

 

B药让细胞质、细胞核、染色体中的BCL6蛋白大量减少

 

但是,与此同时,B药的处理,并不会降低BCL6这个基因的mRNA的表达量。

相比之下,BI-3812,并不降低细胞中BCL6的含量,

 

这与之前的B药会降低细胞中BCL6蛋白含量的特点,是完全不一样的。

为了搞清楚药物引起的BCL6的降低,作者设计了一个报告基因系统。

 

设计思路就如图所示。

 

BCL6基因后面,直接跟了一个eGFP的荧光基因,eGFP会发出绿色荧光。

 

再隔着一个IRES结构单元,后面跟着一个mCherry。这其中IRES是一个可以让核糖体结合的序列,它的作用是让原来的一个转录本,可以有第二个翻译蛋白的起启位点。也就是让一个mRNA翻译出两个蛋白来。

 

mCherry是一个会发出红色荧光的蛋白。

 

也就是说,这里的eGFP、和后面跟着的mCherry,都是起到报告用的荧光蛋白。

 

而且,如果没有BCL6带来的降解效应,那么理论上绿色的eGFP蛋白和红色的mCherry蛋白的数量应该是一样的

然后,来看几种特殊的化合物是否能够阻断,B药引起的BCL6的降解。

 

在这张图中,横轴是用流式细胞仪测到的BCL6蛋白所带的荧光标签的荧光强度。

 

纵轴上,从上到下排列了四组横向的条子,是用不同化合物的影响结果。每种化合物中,又分三条横向的条子,这三个条子分别是DMSO,也就是对照组,BI-3812,和B药。

 

第一组,我们可以看到,B药让BCL6蛋白大幅度减少,但是BCL的抑制剂,BI-3812,并没有让BCL6的蛋白大幅减少。

 

第二组,MLN7243,这是一个泛素激活酶UBAI的抑制剂。我们可以看到,这里,B药的结果和DMSO的结果是一样的。也就是说,当泛素通路被抑制时,BCL6蛋白的数量就不会因为有B药的存在而减少。

 

第三组,MLN4924,这是一个neddylation途径的抑制剂。Neddylation是指NEDD8蛋白结合到目标蛋白的过程,而NEDD8蛋白是一个类似泛素的蛋白。可以看到,在这个组里面,B药是会大幅减少BCL6蛋白的含量的。

 

第四组,MG132。这是一个26S蛋白酶体制剂。可以看到,当有MG132存在时,B药不会使BCL6蛋白的含量下降。

作者为了分析BCL6蛋白中,哪些区段对B药的作用是相关的,做了一系列的截短的重组BCL6蛋白。

 

然后,来看B药对它的们的降解作用。

 

结果如图,当保留前275个氨基酸的时候,B药的降解作用就是有效的,BCL6的蛋白含量是会有大幅下降的,

 

当保留的区域短于前275个氨基酸时,B药的降解作用就失效了。

 

而前275个氨基酸的区段,主要是BCL6蛋白中的BTB区段

 

实验内容的第二部分,BI-3802 诱导细胞 BCL6 光点

这是用B药对BCL6的前275个氨基酸片段的荧光的改变。

 

可以看到,在有B药时,出现了很明显的光点。

 

后来,这些光点又随时间延伸而逐步消失了。

这是用免疫荧光做的全长的天然的BCL6的情况。

 

可以看到,当有B药存在时,BCL6蛋白会聚集到一起,形成光点。

这是在截短到250个氨基酸的BCL6上做的实验。

 

我们可以看到,B药让BCL6聚集成光点,并且光点不随时间延长而消失。

 

也就是说,截短的BCL6蛋白,一方面还是会在B药的作用下聚集起来,同时,还不容易被降解。

 

而加入BI-3812这个竞争性的化合物,会让聚集起来的光点逐步消散掉,也就是说加入BI-3812这个抑制剂,会引起BCL6蛋白的降解。

 

实验内容的第三部分,BI-3802 诱导 BCL6 聚合

作者在用分子量排阻色谱柱纯化BCL6蛋白时,发现如果有B药存在,BCL6的分子就会更快地从色谱柱流出。

 

看这张分子量排阻色谱的图,当有B药时,这个粉红色的峰是提前出现了。而用DMSOBI-3812时,没有出现BCL6提前流出。

 

因此,作者假设BCL6蛋白因为与B药结合,而形成了更高级的结构。

于是作者在电子显微镜下观察,看到当有B药时,BCL6会聚合成波浪样的聚合物,用作者的原话说,叫象正弦波的形状。

 

并且,这个正弦波样的东西,两个波峰之间的间距,是44纳米

接着,作者用计算机模拟BCL6相互连接的空间构象。

 

这里展示了模拟的各种情况。

 

注意一下,这个F2F的构象。也就是face to face的构象

 

作者把各种构象得到的大体样子放在这里,

 

这其中F2F的构象,也就是这中间绿色的这个构象,会得出峰和峰的间距44nm的这个结果。

 

也就是说,这个构象,是与电子显微镜下看到的波浪状的聚合物的形状是一致的。

这是BCL68聚体的样子。

 

其中B药正好嵌进BCL6的一条沟中,与蛋白中的Y58,也就是第58位的酪氨酸,相接触。

 

这方便了与相邻的另一个BCL6上的C84氨基酸以疏水的方式相互接触。

作者想要了解,BCL6中哪些氨基酸对与B药的结合是关键的

 

于是,对BCL6中从第32到第99个氨基酸进行用甘氨酸进行替代的突变扫描。

 

扫描的结果,发现E41AG55AY58AC84A这四个突变,能够大幅抵抗B药的降解作用。

作者为了了解BCL6的氨基酸序列会对形成聚合体有什么影响,做了几个BCL6的基因突变体。

 

图中,是这几个基因突变体的荧光图像。

 

最左边,是野生型的BCL6蛋白,可以在B药的作用下聚集成明显的光点。

 

中间:R28AE41AY58A,这几个突变,BCL6就不会在B药的作用下聚合了。

 

最右边,C84A这个突变可以明显地减少细胞内光点的形成。

这里,是BI-3812B药在蛋白的空间卡位上进行对比的结果。

 

图中,黄颜色的是B药,而橙色的是BI-3812。两种化合物的影象是部分重叠的

 

可以看到,橙色的BI-3812正好多出了一截,而多出来的这一截,正好与相邻的另一个BCL6蛋白造成了空间位阻。

 

这也是BI-3812这个化合物不会诱导形成BCL6蛋白聚合的原因。

 

实验内容的第四部分,SIAH1 参与聚合 BCL6 的降解

接着,作者用sgRNA库筛选的方法,来找出哪个基因对于B药降解BCL6是必需的。

 

作者用了两个方法。第一个方法如图所示。

 

sgRNA文库转染HEK293T细胞。

 

用流式细胞仪对细胞进行分选,eGFP/mCherry的比例最高的5%的细胞,

 

和比例最低的5%的细胞被分出来。

 

eGFPmCherry比例高,就是BCL6稳定,反之,比例低,就是BCL6不稳定。

 

图中左上角的这个三角型中包围的这些点所代表的细胞,就是BCL6最稳定的细胞;右下角的这个三角型中包围的细胞,就是BCL6最不稳定的细胞。

然后,通过单细胞测序,来看那些基因被sgRNA干扰后,会引起BCL6的稳定性的变化。

 

SIAH1FBXO11这两个基因在火山图中的位置被标了出来。

再看4个针对SIAH1sgRNABCL6稳定与不稳定的细胞中的测序read数。

 

可以看到,在BCL6稳定的细胞中,这4sgRNA的测序read数明显更高,

 

而在BCL6不稳定的细胞中,这4sgRNA的测序read数明显更低。

 

而且,没有B药的对照组细胞中,也是这个趋势。

接下来,是作者的第二个办法,目的是看细胞对B药的抗性

 

具体的做法是,先用sgRNA文库转染培养的细胞,

 

再用B药或DMSO来处理这些细胞。

 

最后,进行高通量测序,看哪些基因被sgRNA干扰后,细胞会对B药有抗性。

实验结果显示,

 

SIAH1这个基因,经过sgRNA扫描,在抗性实验,和报告基因扫描,这两个实验中都很突出的唯一一个基因。

 

SIAH1这个基因是一个E3连接酶,它参与泛素化和蛋白酶体介导的特定蛋白的降解。

为了证实SIAH1这个基因在B药对BCL6的降解过程中起到了作用,作者设计了几个sgRNA,这几个sgRNA都是针对SIAH1基因的。

 

从图中,我们可以看到,

 

最上面是阴性对照组的、不针对BCL6sgRNA的效果,很明显,这个红色的条子显示,当有B药存在时,BCL6带的报告基因发出的红光,只有DMSO组的一半左右。

 

下面是6个针对BCL6sgRNA的效果,我们可以看到这6sgRNA形成的红色条子,BCL6带的报告基因发出的光,的强度都高于最上面那行的,无关的sgRNA组的结果。

 

这说明,针对SIAH16sgRNA,都让BCL6变得更稳定

作者再做了过表达SIAH1,和把SIAH1突变,看对BCL6的量的改变。

 

过表达SIAH1基因,无论有或没有B药,都会降低BCL6蛋白的含量。

 

这也提示了SIAH1在内源性地对BCL6的降解作用。

 

而对SIAH1做失活突变,也就是C44S突变,能让BCL6蛋白的含量明显升高。

 

这都说明,SIAH1对降解BCL6有作用。

SIAH1这个E3连接酶,识别“VxP”的氨基酸序列。也就是先缬氨酸,中间任意一个氨基酸,再一个脯氨酸,这样的序列

 

而在BCL6中,第249到第251个氨基酸,是符合VxP这个氨基酸的主题序列的。

作者做了一个BCL6的变异体,包括BTB结构域,加上第241到第260个氨基酸的序列,其中包含了VxP序列

 

可以看到,SIAH1对这个BCL6的变异体的降解能起明显的作用。

作者用重组的BCL6的部分区段的肽段,在体外做实验,看BCL6SIAH1泛素化,然后跑电泳。

 

可以看到这个肽段是SIAH1的底物,在被SIAH1处理的时间越久,就会被接上更多的泛素分子,在电泳上就会出现跑得慢的条带。

 

而加上了B药之后,跑得慢的条带变得更多,说明B药能够加速这种泛素化。

接下来,作者用时间分辨荧光看SIAH1BCL6蛋白的相互作用。

 

左边的图是这个实验的工作原理。

 

SIAH1蛋白上标记了铽元素,

 

BCL6蛋白上标了Bodipy这种荧光剂。

 

如果SIAH1蛋白与BCL6蛋白在空间上靠近,就会发生能量转移,发出波长为520纳米的荧光.

 

右边的图,是实验的结果。

 

当有B药时,520纳米的荧光很强,也就是说BCL6SIAH蛋白在空间上靠得很近。

 

而加入的是BI-3812这种化合物时,和加DMSO的效果差不多。也就是说,BI-3812不会让BCL6蛋白与SIAH1蛋白更加靠近。

这是作者做的细胞内的BCL6SIAH1的荧光照片。

 

这里,BCL6蛋白是加上了eGFP的荧光报告蛋白的融合蛋白

 

SIAH1蛋白是加上了V5蛋白的融合蛋白

 

我们可以看到,当没有B药存在时,BCL6SIAH1都是弥散在整个细胞内的。

 

而当加入了B药后,BCL6就聚集成了光点,

 

同时SIAH1也聚集成光点

 

BCL6的光点和SIAH1的光点,在空间上是重合的。

 

总结

 

 

 

 

 



 

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