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上课笔记|L33协调胶质瘤的微环境并加速胶质瘤的进展
发布日期:2020-11-27浏览:

 

 

 




文章概要





文章的题目,是《Glioma-derived IL-33 orchestrates an inflammatory brain tumor microenvironment that accelerates glioma progression

 

翻译成中文,就是《胶质瘤来源的IL-33协调炎症性脑肿瘤的微环境,可加速胶质瘤的进展》

 

文章的通讯作者,是Donna L. Senger,她是加拿大Calgary大学,Arnie Charbonneau肿瘤研究所的肿瘤学的研究副教授

 




胶质母细胞瘤研究背景





 

胶质母细胞瘤是一种很难治疗的疾病,中位生存期少于14.6个月

 

现在已经清楚,处于不同激活状态的肿瘤中多种细胞类型的存在,会极大地影响对胶质母细胞瘤治疗的效果

IL-33的全名是Interleukin-33,翻成中文,就是“白细胞介素33

 

IL-33参与若干个重要的免疫调节反应

 




实验结果分析





 

第一部分,IL-33在胶质母细胞瘤炎症中存在

作者做了两个小鼠荷瘤模型,而且这两个荷瘤模型是原位荷瘤模型,也就是说这个瘤子是种在小鼠脑子里的,而不象一般的荷瘤模型,是把肿瘤种在小鼠的皮下。种在脑子里的好处是,肿瘤生长在脑子里,和胶质瘤生长在人身上的部位是一致的。

 

两种肿瘤细胞系,其中BT25是一种低浸润性的肿瘤,在免疫上接近于静止

 

BT147模型,是一种高度浸润的、快速生长的肿瘤

 

我们看图,对人类的nucleolin蛋白染色,看到BT25的形成的肿瘤有较清晰的边界,也就是BT25侵入性较弱,而BT147形成的肿瘤的边界是弥散的,也就是BT147的侵入性更强

 

Iba1蛋白是小胶质细胞和巨噬细胞的标志物,对Iba1蛋白的染色,显示BT25中,棕色的Iba1的染色较少,说明炎症反应弱,而在BT147中,染色后,显色的棕色色块要大许多,说明炎症反应强

这是两种肿瘤的荧光染色图,

 

我们可以看到,Iba1BT25这个样本中的表达量明显要少,说明BT25引起的免疫反应要小

 

Iba1BT147这个样本中的表达量明显要多,说明BT147引起的免疫反应要强

作者接着用Luminex的两个分别针对人和小鼠的细胞因子的蛋白panel来检测BT147相对于BT25的表达变化

 

左边的是人类的细胞因子的表达变化,右边的是小鼠的细胞因子的表达变化。

 

在左边的人源的Panel中,可以看到IL33是有明显的升高的,其它还有CCL2CXCL10等细胞因子的表达明显升高

 

在右边小鼠的panel中,可以看到来自宿主小鼠的IL4CXCL10等细胞因子的表达明显升高

 

这是把对照组、BT25、BT147小鼠荷瘤模型中的几个细胞因子的表达量做对比,这几个列出来的,都是在BT147模型中高表达的细胞因子。

其中特别关注一下人类的IL33这个细胞因子,我们可以看到IL33在BT147中的表达量,明显高于在BT25中的表达量,也明显高于在对照组中的表达量,也就是在没有被移植肿瘤的小鼠脑内的表达量

右边的图,是对两种肿瘤的IL33蛋白做western blot的结果,可以明显地看到,BT147中有明显的IL33的蛋白表达,而在BT25样本中,完全看不到目标条带

这是把BT147肿瘤分别培养在培养基中,与种植在小鼠脑内,看它们表达的各个细胞因子的差异

每个小图,左侧的都是培养在培养基中的表达水平,右侧是种植在小鼠脑内的表达水平

可以看到,除了这个人类的CCL7的蛋白之外,其余的6个细胞因子,都是种植在小鼠脑内的表达水平高,而且是明显要高出许多

这其中也包括人类的IL33这个细胞因子,注意一下,在培养基中几乎检测不到IL33,而在小鼠脑中有大量的IL33表达,这说明IL33的表达是受到小鼠大脑环境因素的影响的

这是对IL33与苏木精共染色的结果,苏木精是细胞核的特异染色物质,呈紫色;而针对IL33的染色是棕色

 

我们看到在BT147这个样本中,IL33出现在苏木精出现的位置,这说明IL33蛋白主要是聚集在细胞核的位置

 

这是对BT147样本的荧光染色。

 

最左边的人nucleolin的红色荧光,IL33是蓝色荧光,在空间上进行整合,重合部位显出的橙色的光班。可以看到,IL33的表达的空间位置,是与nucleolin的表达位置高度重合的。

 

nucleolin是胶质瘤的标志性蛋白,这说明,IL33的第一个主要来源是胶质瘤细胞

这是对BT25的切片,做染色的结果

 

可以看到,红色荧光IL33表达的空间位置,

 

绿色荧光是Olig-2的空间位置,

 

DAPI的蓝色荧光显示出来细胞核的位置重合,三者在空间上高度重合

 

Olig-2是少突胶质细胞的表达的一个特征基因

 

这说明IL33的第二个表达来源,是表达olig-2的少突胶质细胞

 

实验内容的第二部分,IL-33胶质瘤与肿瘤相关巨噬细胞浸润有关

作者为了确认IL-33是否在胶质瘤中普遍地有表达,查了35个引起脑瘤的细胞培养物样本,和26个原始的胶质瘤样本,对这些样本做了RNA-seq

 

结果是超过50%的样本有IL-33的表达。

 

并且,培养细胞中有,35个样本中有8RPKM大于10reads26个原始样本中,有8个的RPKM大于10reads.

 

对培养细胞做western blot,可以看到部分样本有明显的IL33的表达

培养的脑瘤细胞系中的IL33的表达,与对应的组织样本中的IL33的表达有相关性,

 

相关系数r等于0.6P值等于0.004,也就是有显著的相关性

作者为了进一步研究IL33与巨噬细胞浸润的相关性,挑选了5种高IL33的细胞系,和5种低IL33的细胞系,分别做移植瘤动物模型

 

图中,上面两行是高IL33,下面两行是低IL33的。

 

从图中可以明显地看出,高IL33的这些样本,其中表达的Iba1蛋白,要远多于低IL33的样本。

 

右边的,是定量检测有表达Iba1的巨噬细胞的数量,可以看到,差别很明显,而且P值达到了0.006的水平

接着作者对第二对移植瘤样本中的细胞因子表达做了分析。

 

加入的这对样本,是有炎症的移植瘤BT53,和没有炎症的移植瘤BT73

 

BT53中,三种细胞因子IL33CXCL10CCL2的表达量,都要明显高于没有炎症的BT73

作者接着拿了另外的,独立的一个组织芯片,来看IL33与其它细胞因子之间的关系。

 

这个组织芯片含了70个胶质母细胞瘤。

 

这上面的三组图,是分别针对三个细胞因子蛋白IL33Iba1、和CD163染色的结果,

 

每组图中,上层是大图,下层是的图是把大图中的一部分放大后的效果。左边是低表达这个细胞因子的样本的图,右边是高表达这个细胞因子的样本的图,

 

综合起来,我们看到,在Iba1低表达的15个样本中,IL33低表达与高表达的比例是14:1

 

而在Iba1高表达的49个样本中,IL33低表达与高表达的比例是38:11

 

也就是说,在Iba1高表达的样本中,有更多的样本是IL33高表达的。而且显著性P值是0.17

 

再看CD163IL33表达的相关性,38CD163低表达的样本中,IL33低表达与高表达的比例是35:3

 

而在CD163高表达的32个样本中,IL33低表达与高表达的比例是23:9

 

也就是说,在CD163高表达的样本中,有更多的样本是IL33高表达的,而且显著性P值是小于0.05的。

 

这支持了这样一种推断,就是,IL33会招集促肿瘤源性巨噬细胞

 

这也与之前的报导,巨噬细胞和小胶质细胞表达IL33的受体ST2,并且IL33能让巨噬细胞极化变到M2表型,是一致的

这是胶质母细胞瘤中的ST2基因的表达,比较的是肿瘤组织和培养的肿瘤细胞系

 

红色的柱子,是原始的组织样本,

 

绿色的是从相应的组织样本得到的细胞系。

 

我们可以清楚地看到,组织中有ST2的高表达,

 

而细胞系中,很少有ST2的表达。

 

实验内容的第三部分,分泌的与核中的IL-33促进肿瘤进展

为了看IL33的表达,对肿瘤进展的推动作用,作者做了两个表达IL33的重组基因质粒。

 

第一个质粒里的IL33基因是完整的

 

第二个质粒里的IL33基因少了一段把该蛋白定位到核中的序列,

 

也就是少了nuclear localization signal这段,就是缩写为NLS的这一段。

这是重组质粒在培养细胞中进行表达的结果,

 

野生型的IL-33显出33K 道尔顿的条带

 

突变型的显出25K 道尔顿的条带

 

这是对野生型与突变型的IL33做的在细胞中的空间定位的结果。

最左边这一列是IL33的荧光染色,中间这一列是DAPI的荧光染色,DAPI荧光是针对细胞核的荧光,会显示出细胞核的位置,右边的这一列是把两种荧光整合在一起看到的结果

最上面一行是空白对照组,是转染的空质粒,中间一行是野生型的IL33,最下面一行是突变型的IL33

我们可以看到,野生型的IL33,大量集中在细胞核内;而突变型的IL33,则在细胞核之外。

这与设计的预期是完全一致的,就是IL33的5’端的部分的序列,能指导IL33定位到细胞核内,而缺失了这一段序列,IL33就不会定位到细胞核内,而是会跑到细胞核外面去。

这是用三种质粒转基因后的U87细胞,做的荷瘤小鼠模型。

这9张图,是肿瘤细胞种到小鼠脑内3周后的情况。

最左边这一列,是空质粒;中间这一列,是用野生型的IL33基因;右边这一列,是用缺失型的IL33基因

最上面这一行,是针对人的nucleolin蛋白的染色,也可以当成是看人类脑瘤在小鼠脑子里长得有多大。可以明显地看到,野生型的IL33的肿瘤长得最大,缺失型的肿瘤长得很小,

在这里面Iba1这个蛋白巨噬细胞与小胶质细胞的标志物,在野生型IL33的肿瘤中表达量是较高的,在IL33缺失型的肿瘤中表达量是相对低一点,在对照组中是最低的。

而对IL33蛋白的染色,在IL33野生型的中,染色是最深的;在缺失型中,染色要浅许多;在对照组中,完全没有染色。

这组图说明转了野生型IL33基因的肿瘤细胞,生长很快,而转了缺失型IL33基因的肿瘤细胞,生长要慢许多

左边这个图,是在体外实验中,质粒转基因细胞的培养生长情况。我们可以看到野生型、与缺失型IL33的转基因细胞的生长情况是差不多的,

 

对比之下,在荷瘤小鼠模型中,肿瘤细胞的生长的差异要大许多。

 

所以,这可以支持这样一个结论:这两种转基因细胞在小鼠体内表现出的巨大差异,是与宿主小鼠的相互作用导致的。

接着,作者做了荷瘤小鼠的生存期长度的实验。

 

图中,横轴是生存的天数。因为生存期的长度跨度很大,所以图片中横轴中间是有截图的,

 

图中的折线,红色的是野生IL33 ,生存期是20多天;右边黑色三角和黑色小圆点,是缺失型的IL33,生存期长达300500天。中间是空白质粒的,小鼠生存期是4080天。

 

很明显,野生型IL33的肿瘤细胞让小鼠死得更快,而缺失型IL33的肿瘤细胞,让小鼠死亡的速度要慢许多。

这是用流式细胞仪来分析荷瘤小鼠脑中的表达CD11b蛋白,同时不表达Gr-1蛋白的细胞数。

 

这里IL33是野生型IL33的实验组,control是加入了空质粒的实验组,Sham是指做了手术,但只注射了生理盐水的小鼠。

 

从图中,可以看到IL33这组,目标细胞数量最大;control这组的目标细胞数量中等;sham这组中,目标细胞数量最少。

左边的F图,在骨髓来源的巨噬细胞,用野生型与缺失型的IL33蛋白处理,看巨噬细胞的移动。可以看到两组巨噬细胞分别受到野生型与缺失型的IL33招集,巨噬细胞的迁移差不多。

 

右边的G图,是对不同剂同的野生型的IL33的招集作用的测定结果,可以看到,随着剂量的增加,招集的巨噬细胞就越多。其中,最右边的那个柱子,是加了针对IL33蛋白的抗体后的效果。可以看到,当加入了抗体之后,招集的巨噬细胞的数量是减少了。

 

这说明,在体外实验中,野生的、和缺失型的IL33都有招集巨噬细胞的能力

接下来,作者在有免疫力的小鼠脑子中种编号为K1492的小鼠胶质母细胞瘤。注意,这个K1492是来自“小鼠”的胶质母细胞瘤细胞,与之前用的人源的肿瘤细胞有种属上的差别

 

这里的K1492细胞成通过基因工程改造,表达鼠源的IL33.

 

接着把,改造过的K1492肿瘤细胞种到免疫正常的小鼠脑子中。

 

这里,IL33就经过基因工程改造,能表达IL33的肿瘤细胞种到脑子里的效果,旁边control的这个细胞是转基因了空质粒的对照组。

 

经过H&E染色,可以看到有表达IL33的这个样本中,肿瘤面积很大,并且肿瘤中有大量的Iba1蛋白的染色,也就是巨噬细胞在这里大量富集。

 

而对照组中,H&E染色看出来的种瘤面积要小许多,并且肿瘤中的Iba1的染色要淡一些,也就是巨噬细胞在这里的富集程度要低一些。

 

计算了两种情况下的小鼠的生存时间。可以看到红色的线所代表的有表达IL33的小鼠的生存期,从十几天到四十多天,生存期明显短。相比之下,对照组的生存期是20多天到大几十天,差别很大。

 

这个实验说明了,在小鼠体内,鼠源的IL33会起到类似于人源的IL33在荷瘤小鼠模型起到的作用。

 

实验内容的第四部分,核中的IL33促成趋向肿瘤发生的环境

为了分析IL33如何促进肿瘤发生,作者做了来源于人U87胶质瘤细胞的三个克隆,而且这三个克隆都表达IL33,用Affymetrix的生物表达芯片分析了这三个克隆的基因表达。这是表达的热图

对上面三个克隆中高表达基因进行GO分析,

 

发现富集的基因中,有三类基因是与细胞因子、炎症反应有关的

作者对用野生型、和缺失型IL33转基因的胶质母细胞瘤细胞做细胞因子的表达分析。

 

图中,黑色的柱子是转基因了野生型的IL33的表达情况,灰色的柱子是转基因了缺失型的IL33的表达情况,白色的柱子是对照组的情况。

 

在绝大多数的细胞因子,都是在有野生型的IL33的细胞中表达更高,这说明这些基因的表达都受到IL33在细胞核中的影响

 

但是有一个例外,就是CCL2CCL2是在缺失型IL33的细胞中表达更高。

对于来自TCGA的基因数据,结合作者自己的GBM基因队列数据,做基因表达的相关性分析

 

结果证明IL33mRNA表达,与促癌M2巨噬细胞标记物之间呈正相关。

分析IL33表达与M1M2巨噬细胞标志基因的关系,可以看到在肿瘤干细胞簇中,IL33表达量高的,对应于M2巨噬细胞标志基因的表达量也高;反之,IL33表达量低的,对应于M2巨噬细胞标志基因的表达量也低。

作者设计了一个分数,这个分数叫ssGSEA,它是single-sample gene set enrichment analysis的首字母缩写,意思是“单样本基因集富集分析”。

 

IL33up ssGSEA,就是指包含的基因是那些TCGA数据库中的GBM肿瘤中,与IL33表达正相关的M2巨噬细胞marker基因。

 

在这张生存期的图中,

 

红色线是这个得分高的人的生存期,蓝色线是这个得分低的人的生存期。

 

可以看到红色线,也就是IL33上调得分高的这些人的生存期明显要短,而蓝色线,也就是IL33上调得分低的这些人的生存期明显要长。而且两者差异的显著性P值为0.0002,差异十分显著。

 

也就是说IL33上调的这些基因,会让生存期变短。

这是对转基因肿瘤的荷瘤小鼠中的精氨酸酶1,也就是Arg1表达量的检测。

 

转基因用的质粒分三种,左边是空质粒,中间是野生型的IL33基因,右边是缺失型的IL33基因.

 

用了两种胶质母细胞瘤的细胞株,上面这行用的是U87细胞,下面这行用的是U251细胞

 

我们可以看到,中间一这列,野生型的IL33的实验组中,可以明显看到Arg1的表达,而缺失型的IL33的那些样本中,几乎看到不Arg1的表达

再用荧光抗体来看几种转基因的荷瘤小鼠中Arg1Iba1的表达。

 

很明显,在缺失型IL33样本中,几乎没有Arg1的表达。

 

而在野生型IL33样本中,Iba1Arg1的表达在空间上有明显的重合

接着,作者检测了荷瘤小鼠中,抑制炎症与促进炎症的细胞因子的表达。

 

左侧是抑制炎症的细胞因子的表达图,右侧是促进炎症的细胞因子的表达图

 

左侧6个小图是6个细胞因子。

 

每个图都是三个柱子,左边的柱子是对空质粒的对照组,中间的柱子是野生型的IL33,右边的柱子是缺失型的IL33.

 

可以明显地看到,每个图都是中间的柱子最高,也就是这些抑制炎症的细胞因子,都是在野生型IL33的这一组中表达量最高。

 

再看右边的这组图,这组图都是促进炎症的细胞因子。可以看到,四个细胞因子的表达,野生型和缺失型IL33的结果都差不多,只有小鼠的白介素beta的这个组,是野生型IL33的样本中表达最高。

作者接着在有免疫力的小鼠身上,接种来自鼠源的转基因的K1492细胞,

 

从图中可以看到,IL33的转基因肿瘤细胞在小鼠脑中形成的肿瘤,体积明显要比对照组的肿瘤体积大。

 

并且IL33转基因的这一组中,Arg1蛋白的表达要高许多,也就是肿瘤相关的巨噬细胞更多。

作者接着评估了其它研究中鼠源IL33Arg1的相关性。

 

在几种转基因小鼠中,发现PDGFB的转基因小鼠中,鼠源IL33高表达,而且明显比别的几种转基因小鼠高许多。

 

同时PDGFB转基因小鼠中Iba1高表达,有表达Arg1的肿瘤相关巨噬细胞浸润。

 

相对应的,PDGFANF1转基因小鼠中,表达Arg1的肿瘤相关巨噬细胞浸润水平很低。

作者用表达谱芯片测了PDGFB转基因鼠中,抑制炎症反应因子的表达,

 

可以看到PDGFB转基因鼠的的各个抑制炎症反应因子都相对于其它小鼠是明显高表达的。

 

实验内容的第五部分,IL33在脑肿瘤中的功能作用

作者从小鼠中分离并纯化BMDM细胞,也就是骨髓来源的巨噬细胞,用重组的IL33处理,然后看细胞因子的表达。

 

图中,灰色的柱子是IL33处理后,细胞因子的表达量,黑色的柱子是对照组的细胞因子表达量。

 

可以明显地看到,灰色柱子显著高于黑色柱子,也就是IL33处理之后,细胞因子的表达量大大增加。

这是IL33的剂量与各个细胞因子表达量的关系,

 

可以看到,基本上都是IL33剂量越大,细胞因子表达量越高。也就是这些细胞因子的表达,都受IL33的正向调控

作者又用重组的IL33来处理人类胎儿小胶质细胞,看细胞因子的表达。

 

从图中,可以看到,这些细胞因子、趋化因子,在受到IL33的处理之后,表达都有升高,而且绝大多数都是IL33剂量越大,细胞因子表达量越高。

 

这表明这些细胞因子的表达,都受到IL33的正向调控

接下来,BMDM细胞用培养过胶质瘤细胞的培养基来处理,看BMDM细胞的迁移的改变,而胶质瘤细胞是经过野生型或缺失型IL33转基因的。

 

发现野生型和缺失型的IL33,都会导致BMDM细胞的迁移,并且迁移的程度是一样的。

 

进一步的实验,可以看到,这种迁移可以被针对IL33的抗体,或者针对CCL2的抗体减弱。

用重组的IL33蛋白做实验,表明仅IL33就足以介导DMBM细胞的迁移行为。

 

如图所示,IL33的浓度越高,DMBM细胞的迁移就越大,而且这种介绍迁移的作用,可以被抗IL33的抗体部分中和

作者接着用质谱来分析了IL33对荷瘤小鼠的肿瘤细胞里的信号通路分子的磷酸化作用。

 

图中,左边的三例是三个对照组的样本,右边的四列是四个用IL33转基因的肿瘤样本。

 

红颜色是磷酸化程度高,蓝色是磷酸化程度低,

 

可以很明显地看到,四个IL33转基因的肿瘤中信号通路分子的磷酸化水平更高。

 

右边的这些序列,就是这些信号分子蛋白中有磷酸化位点的那部分序列,其中红颜色标的Y字母,就是酪氨酸所在的位置。

 

其中STAT3的第705位的酪氨酸,是一个已知的与胶质瘤进展相关的位点。

 

实验内容的第六部分,表达IL-33的神经胶质瘤募集外周免疫细胞

这是作者把转了IL33基因的鼠源胶质瘤种到小鼠脑子里之后,用流式细胞仪根据各种免疫细胞的标志性蛋白来检测肿瘤中的各种免疫细胞的数量。

 

这里一共8张图,每张图都是一种免疫细胞。

 

我们可以看到,前7张,都是用IL33转基因的肿瘤样本中,免疫细胞的数量最高;没有转基因的肿瘤中免疫细胞数量较少;而做了假手术的组,免疫细胞的数量都是最少的。

 

只有最后一张图,稳态小胶质细胞,IL33转基因组中的这种细胞最少。

接着,作者做了转基因的人源胶质瘤细胞U87种到小鼠脑子中的实验。与前一页幻灯片的差别是,前一张幻灯片是鼠源的胶质瘤细胞,而这张幻灯片是人源的胶质瘤,并且多了一组缺失型的IL33转基因的结果

 

可以看到,大部分免疫细胞,都是第三列的数值最高,也就是野生型的IL33这组中,被招集来的免疫细胞最多。

 

除了稳态小胶质细胞这组,这组是IL33转基因的细胞数是较少的。

接下来,作者从3个表达IL33的、和3个不表达IL33的荷瘤小鼠模型中,取样做单细胞测序,一共是38千个细胞。

 

左图是把这三万多个细胞做的聚类。

 

右图,是按照是否表达IL33,用红色与绿色标示的细胞。

 

在表达IL33的细胞中,有三个簇是与别的细胞簇分开的,就是编号为7913的这三个簇。

 

7号簇是单核细胞,9号簇是NK细胞,这支持了IL33能招集髓系的细胞的观点。这与之前荷瘤小鼠的流式细胞仪的分析结果是一致的。

 

13号簇是粒细胞。

而在7913号簇中表达IL33的细胞里面,CD45+的细胞比率明显更高。

 




总结







 



 

 

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