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重大突破!晶能生物空间转录组测序服务第一批正式样品完美收官
发布日期:2020-01-21浏览:

去年底,晶能生物10x Visium空间转录组业务正式上线,获得了广大的关注,临近春节放假,今天小编得到技术部门给予的最新消息“第一批样品已经做完了,结果很不错”。

小编搜了下各大网络平台,貌似我们还是“全网第一家”官方正式宣布完成第一批正式样品空间转录组测序全程服务的第三方测序服务平台公司!

 


前段时间,为了便于各位老师进行课题设计和样本准备,我们已经发布过关于10x Visium空间转录组测序的基本流程和介绍,参阅“新年贺礼:晶能生物全面开启10x空间转录组服务”。

其主要步骤包括以下四个部分:

样本准备

组织优化

空间转录组建库及测序

数据分析

 

目前晶能公司技术部门通过接近1个月的摸索和实验,通过第一批正式样品的实验过程,理论切合实际,整理完善出了一套针对空间转录实验过程的关键控制点和经验模型。今天就给大家分享一部分:

1、样本准备阶段


跟单细胞转录组类似,空间转录组的样本准备也非常重要,会极大的影响后续的结果。所以样本准备一定要非常谨慎,严格按照要求来做。

样本准备的主要内容和步骤如下:组织速冻→OCT包埋→组织切片→RNA质控。

下文会分享一些我们在第一批样品实验过程中的一些资料和经验。

 

1、组织速冻+OCT包埋

上图就是本次第一批空间转录组正式样品(已包埋处理)

 

2、 组织切片

公司拥有Leica组织切片机,样品正在被小心翼翼切片

 

3、 RNA质控

上机RNA质控

质控曲线

 

在本次空间转录样本处理期,实验室部门前前后后摸索了40多个样本范例,通过操作实验总结出不同样品质控核心关键点:

1. 样品血液需要除去干净,速冻尽量去除PBS残留,避免发生结晶,会影响后续实验。

2. 提前记录标记好样品的摆放位置,拍照确认组织的空间方位。

3. 较大的组织样本在切片前需要进行组织划分,以生成适合捕获区域大小的样本。

4. RIN值的检测是关键的一个质控点,可用来确定样本是否可以进行后续实验。

5、........

6、.........

 


2、HE染色+组织优化


对于第一次进行实验的样本,都需要做组织优化。组织优化的目的是找到最佳的透化时间,以便正式实验得到最好的效果。

其实验流程为:固定-染色-明场拍照-组织透化-荧光cDNA合成-组织移除-荧光扫描,根据荧光强度判断最优的透化时间。

实验室大公开

美女实验室小姐姐染色中

观察影像

 

下图右侧是组织优化的示例结果,左上角第一个区域为阳性对照,不放组织切片,而是直接加入RNA,肯定带有荧光。而右下角0分钟的区域为不加透化剂的阴性对照,不发荧光。

出于样本保密性,这里仅展示示例结果

 

以下内容是晶能技术部门经过操作实验总结的组织优化核心关键点:

1. 组织优化过程需根据荧光强度来判断最优透化时间,如取样组织差异较大,需多次组织优化。

2、........

3、.........

 

 

3、建库测序


空间转录组玻片包含4个捕获区域(6.5 x 6.5mm),可做4个样本。这四个区域可以做同一个样本的重复,也可以做不同类型的样本。

其简单的验流程是:固定,染色以及明场拍照→组织透化及cDNA合成→二链合成→cDNA扩增→文库构建→高通量测序。

 

正式实验相当于在组织优化的步骤上继续往下完成文库的构建和测序。做好前面的样本准备和优化工作后,这部分出问题的概率就不大了。

文库质检合格,片段大小无误,峰型正常

上机测序illumina NovaSeq 6000

 


4、数据分析


由于这部分涉及到大量保密问题,就不方便多阐述,生信部门也是天天加班,我看小哥哥们头发又少了一些(变秃了,也变强了~)。

 

简单阐述下空间转录数据分析的基本:

目前使用的分析软件主要是Space Ranger 1.0.0,输入的文件除了常规的下机数据,还需要前期HE染色的图片,JPG和TIFF格式的都可以。

 

通过分析主要可以得到基因表达矩阵和空间转录组的聚类结果,且可以对不同类型细胞进行差异表达分析。通过可视化软件Loupe Browser 4.0.0可以对分析得到的结果进行更精细的比较和分析。除了用于后续的分析之外,Loupe软件还可以对space ranger无法处理的图片进行手动基线校正,确保大部分染色结果都可以进行后续分析。

 

示例的分析结果如下:

 

部分分析结果图:

 


在本次空间转录组测序样品的处理,组织优化,文库建库和测序过程中,晶能生物技术部加班加点,最终克服万难,成功完成第一批正式客户样品!
在此过程中也收集总结了诸多经验和关键质控点,欢迎所有对空间转录组有兴趣的老师,联系我们销售或技术服务人员。
咨询热线:4009200612

 

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