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上课笔记|LIBRA-seq:快速高效制备单克隆抗体
发布日期:2020-07-27浏览:

 

 

 

 

 

 

 

 

LIBRA-seq是Ian Setliff等科学家开发出的一种全新的制备单克隆抗体的方法。

 

这个方法的优点是:

 

1.速度快。一般一周时间就可以得到抗体基因序列。

2.适应性广。可以适用于各种细胞悬液,抗性B细胞的来源不再限于免疫后的小鼠的脾细胞。

3.可一次针对多种抗原。可一次实验中可以找的抗原种类可以多到几十种,极大地提升了找抗原的效率‍。

 

在晶能生物特邀名师讲堂第七课中,“陈巍学基因”创始人陈巍老师会为大家详细解读了LIBRA-seq这项新技术。‍

 

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文章内容

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

文章的题目是《High-Throughput Mapping of B Cell Receptor Sequences to Antigen Specificity》

翻成中文,就是《B细胞受体序列到抗原特异性的高通量映射》

文章发表在2019年12月的Cell杂志上

作者是范德比尔特大学的博士研究生,Ian Setliff。

文章中用到的技术叫LIBRA-seq

 

LIBRA-seq是 Linking B cell Receptor to Antigen specificity through sequencing 的首字母缩写

翻成中文,它的意思是:通过测序将B细胞受体与抗原特异性连接

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LIBRA-seq的特点

 

1、快,实验周期是一周。实验可以从有免疫力的人外周血开始,不必要专门去免疫小鼠

2、多,一次可以针对多种抗原,来寻找相应抗体

3、全,得到的信息很全,一次实验就可以得到配套的抗原种类、抗体重链和轻链的全部序列信息

4、明,测序的数据,直接就提示了抗体对抗原的结合特异性、和对病毒的中和谱,信息很明确‍

 

 

 

 

 

 

 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

LIBRA-seq的方法原理

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

第一步,是在抗原上通过生物素和链霉亲和素,连上PE荧光染料。PE荧光染料将用于下一步的流式细胞仪的荧光分选过程

再在抗原上连上带有特定条形码序列的DNA链,作为抗原识别标签。

在这个整个的实验有点象钓鱼,特点是一种鱼只吃某种特定的鱼饵,那多放几种鱼饵就可以一次多钓到一些鱼,给每种鱼饵都做上标签,那么抓到鱼之后就可以从鱼饵的标签来判定鱼饵的种类,进而能判定鱼的种类

 

第二步,把多种带标签的目标抗原,和有免疫力的人的外周血单核细胞进行混合孵育

孵育的目的,让抗原与带有对应抗体的B细胞进行相互识别,并且结合

 

第三步,把孵育过的混合液用流式细胞仪进行荧光分选

因为目标抗原是被标上了荧光染料的,所以结合有目标抗原的B细胞就会被分选出来

 

第四步,把分离出的带荧光抗原的细胞进行10x处理,10x仪器把细胞、抗原、带标签的凝胶微珠,分隔成一个一个的油包水的小液滴。

接着进行建库,通过逆转录,再用特定引物做PCR扩增,建成二代测序文库

通过二代测序,得到“配套的:抗原标签DNA序列-抗体重链序列-抗体轻链序列”,三个一组的紧密关联的核酸序列信息

 

第五步,有了抗体的基因序列,我们就可以通过基因重组表达,得到目标抗体

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LIBRA-seq相比于传统开发单克隆抗体方法的优势

 

 

 

 

 

 

 

 

 

传统的方法,主要是两种,一种是用杂交细胞瘤,另一种是噬菌体展示

第一点,就是LIBRA-seq很快,从有免疫力的血液样本开始一直到得到基因序列,就花一周的工作时间

相比之下,用杂交瘤方法,至少要用5~8周。因为其中要把脾细胞与肿瘤细胞进行融合,再进行单克隆化,再进行免疫活性筛检。

LIBRA-seq的时间只相当于杂交瘤方法中细胞融合这第一个步骤所花的时间

所以说,LIBRA-seq是非常快的

 

第二点,可以用被感染过的、有免疫力的人的外周血,取其中的单核细胞,就可以做LIBRA-seq,也就是离心得到白细胞,就可以做LIBRA-seq,不一定要免疫小鼠或兔子。

这在要控制急性的传染性疾病,要制备中和抗体的情况,就直接省了免疫动物的时间。

 

第三点,LIBRA-seq能得到配套的目标抗原的条形码序列,和相应抗体的重链序列加轻链序列

因为目标抗原、完整的B细胞,和带有条形码的微珠,被包在一个油包水的小滴中,保证了这三个组成成份的条形码序列,可以一次性地被完整地获得

相比之下,噬菌体展示,一个噬菌体只能保留轻链,或者重链序列,不能一次性获得一个抗体的配对的轻链、重链序列,还要后期再想办法配对,操作麻烦

 

第四点,一次实验可以筛多个抗原。

因为LIBRA-seq的实验过程中,用DNA标签对抗原做了标记,所以可以轻松区分多种抗原,这就允许一次实验中放入多种抗原作为钓抗体的鱼饵,并且一次筛到不同抗原的抗体

论文当中的例子,是一次筛9个抗原。作者Ian在一次网络演讨会中说团队实际上做过一次筛14个抗原的

 

第5点,“LIBRA-seq得分”直接显示了抗体的结合特异性

“LIBRA-seq得分” 就是指一个LIBRA-seq中测序测到的一种抗体基因在一种抗原上所表达的RNA的UMI数。UMI数多,说明这个抗体对这个“饵”蛋白咬得牢

实验证明,LIBRA-seq得分与ELISA识别准确度高度正相关

这里是9个抗体的编号,作者把这9个抗体表达成了重组抗体,与抗原做ELISA实验

这是LIBRA-seq得分,颜色越偏紫,则LIBRA-seq得分越高,

这是ELISA识别准确度,颜色越偏紫,则ELISA识别准确度越高。

我们可以清楚地看到,LIBRA-seq得分与ELISA识别准确度高度正相关

所以,LIBRA-seq得分可以指导挑选好的抗体,简化挑抗体的过程。

而且,“LIBRA-seq得分”是很容易统计的数据,就是数一下归属于特定抗原特定抗体的的UMI数。这很容易做到,

所以说,“LIBRA-seq得分”是一个方便统计的指标,而且指示效果也很明确

 

 

 

 

 

 

 

 

 

LIBRA-seq的运用实例

 

 

 

 

 

 

 

 

 

论文中一共对两个人的样本做了实验,这两个人都是HIV病毒的长期携带者

我们先说第一个供体,这个供体的编号是NIAID45。

之所以选择这个供体,因为他有一系列特点

第一个特点,是他17年前就被检出有HIV病毒,至今没有经过抗逆转录病毒的治疗,也就是没有经过针对艾滋病的治疗,但他现在活得很好

第二个特点,是之前有许多论文拿他的样本做了分析,所以对他这个样本已经有了很好的科研基础数据

 

实验中,是取了这个人的外周血中的单核细胞,也就是白细胞,做实验

用三种蛋白做饵蛋白,其中两个是HIV的包膜蛋白,另一个是流感的抗原蛋白

把这三种蛋白作为钓B细胞的钓饵,与白细胞进行混合,做实验

 

实验回收到了2321个有用的B细胞信息

这张图是抗体的谱系图

图中红色的抗体,是新发现的、抗HIV蛋白的抗体

黑色的抗体,是以前的论文中已经发现过的抗HIV的抗体

在整个抗HIV抗体谱系的各个分枝中,都有新发现的抗体

这说明:LIBRA-seq有充分的能力,来发现针对靶标蛋白的抗体

 

作者挑了几个的新抗体,用基因工程方法表达后,做抗体对病毒的中和能力的测试

从上到下,列的是一系列不同的HIV的伪病毒毒株

用三个重组抗体,来测试对这些伪病毒的中和能力。

这个VRC01是一个以前已经验证过的抗体,放在这里做阳性对照

图中红色表示中和能力强,上面标的IC50数字,是半抑制浓度,这个浓度的数值越低,说明抗体的中和能力越强

三个重组抗体中,两个表现出对各种HIV伪病毒的很强的中和能力,一个表现出很弱的中和能力

这个实验说明,LIBRA-seq找出来的抗体,大部分能够中和病毒

这对药厂开发针对病毒中和抗体很有意义

 

这张图,前面提到过,它说明LIBRA-seq找出来的抗体基因序列,经过基因工程表达成抗体后,能够很好地识别目标蛋白,“LIBRA-seq得分”与ELISA识别准确度有高度的一致性

 

接下来说第二个供体,他的编号是 NIAID N90

他的特点是,1,他携带HIV病毒活了23年,现在活得挺好

2,在先前的文章里从他身上鉴定了一种广泛的HIV中和抗体谱系,称为VRC38,但是供体N90的血清的病毒中和宽度,显著大于VRC38的中和宽度

所以想用LIBRA-seq方法从他的血液中找出更多的抗体

 

用9个饵蛋白做实验

其中5个是HIV的蛋白。这5个HIV蛋白,是来自5个不同的HIV毒株

4个是流感的蛋白

 

这是N90的抗HIV的抗体谱系图

图中红色的,是新找到的抗体。这说明LIBRA-seq是可以找到更多抗体的

 

之所以测N90这个供体,是想找中和谱更广的抗体,我们就来看找到的抗体的中和谱宽度

能够中和更多HIV毒株的抗体就是中和谱更宽的抗体

这里列出了5种抗原蛋白,也就是之前做饵蛋白的5种蛋白

LIBRA-seq得分直接可以看出哪些抗体与哪个抗原有结合,下图中的深黑色的圆点,就是有结合的

可以看到,最右边,有33种抗体能抗这里列的全部5种抗原蛋白

所以,可以根据LIBRA-seq得分来预判抗体的中和谱宽度

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

总结

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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