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10x scRNA-seq案例解读丨肝癌循环肿瘤细胞(CTC)中的应用
发布日期:2018-12-14浏览:

本文以“High-density single cell mRNA sequencing to characterize circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma”为题2018年8月发表于《Scientific reports》杂志。 

 

肝癌循环肿瘤细胞的高密度单细胞转录组分析

 

 

研究背景

 

肝细胞癌(HCC)患者将肿瘤细胞释放到血中,可用细胞表面标志物进行检测。 许多报道表明,循环肿瘤细胞(CTC)数量与不良临床结果之间存在直接关联,但很少有研究提供CTC分子全面表征。 由于在HCC晚期患者中获取组织样本的机会有限,因此开发新技术常规临床条件下鉴定HCC癌症驱动因素至关重要。

 

本文研究人员采用顺序结合图像流式细胞仪和高密度单细胞mRNA测序,以识别HCC患者的CTC。 使用该方法进行基因组表达分析证明CTC异质性并且有助于检测HCC中已知的致癌驱动因子,例如IGF2。这种整合分析方法为使用液体活检HCC生物标志物开发提供了新方向

 

 

研究思路

 

为实现CTC转录组的全面表征,开发了一种结合成像流式细胞仪(IFC)和单细胞RNA测序(scRNA-seq)的分析管道。使用8 mL全血,包括3个连续步骤:(1)CD45阴性富集(2)使用IFC选择患者(3)使用10x scRNA-seq(图1)。

 

 

 

图1. 研究思路

 

主要研究内容

 

1. 10x scRNA-seq鉴定CTC

 

分别对患者1和2中的7104和3130个细胞进行了10x scRNA-seq,使用变量最大的基因来计算数据集中变异性的主要来源,如主成分(PC)分析所示。该方法鉴定了来自患者1的两个CTC和来自患者2的一个CTC,其基因表达谱与血液中的其他克隆群体显著不同。接下来基于基因表达谱来表征其余的血细胞,鉴定了与单核细胞、NK细胞、B细胞T细胞、浆细胞样树突细胞和红细胞相容的细胞(图2C、2D)。

 

 

 

2.10x scRNA-seq鉴定CTC

 

 

2.潜在HCC驱动基因的鉴定

 

比较来自2名患者的3个候选CTC与其余细胞的比例表达值时,在100个顶部差异表达基因中发现了许多肝脏相关基因(图3A)。这些基因参与肝脏生理学,包括载脂蛋白、凝血因子、乙醇脱氢酶、细胞色素等。为进一步支持这些异常细胞的肝谱系与所有其他细胞相比对其缩放表达进行了基因集富集分析(GSEA),胆汁酸和异生素代谢在这些细胞中最顶层富集(图3B)。

 

10x scRNA-seq对于使用全转录组数据准确区分CTC至关重要。当检查ASGPR1(一种用于检测HCC15中CTC的标记物)的表达时,发现它在很大比例的非CTC中表达,主要是单核细胞(图3C)。总之,这些观察结果进一步证明了用于CTC检测的单一(或靶向)标记物方法的局限性,10x scRNA-seq在HCC患者的血液中检测到具有高度暗示肝谱系的细胞

 

 

3. 10x scRNA-seq鉴定HCC驱动基因并揭示CTC中的分子异质性

 

在两个患者中,候选CTC表达肝细胞癌上调非编码RNA(HULC),而在其他血细胞中不存在 HULC是一种在HCC17中具有已知致癌特性的lncRNA还检测到在HCC中频繁上调的其他基因,如SPINK1、IGF2、SPP1或BRIC5,表明肝脏谱系的循环细胞既未在健康供体的血液中检测到,也未在非恶性慢性肝病患者中检测到,支持了候选CTC的恶性特征。CTC中差异表达的基因中,检测到IGF2的过表达(图3A),该基因在20%的早期HCC中过表达并且表征为HCC附睾。仅通过探测肿瘤的突变情况不能评估IGF2的调节,这使得CTC的10x scRNA-seq成为检测非突变的可药用基因组突变(如IGF2过表达)的工具

 

除了IGF2之外,许多基因在患者1中检测到的两个候选CTC之间差异表达,此外,GSEA揭示了在该患者2个候选CTC中富集的排名最高的基因集的差异,包括提示CTC#1中更具侵略性的生物学行为的特征(图3B,如E2F靶标、G2M检查点、KRAS信号传导)这些数据表明CTC区室中的转录组异质性,使用scRNAseq表达谱可以帮助追踪CTC中的癌症异质性

 

3. CTC的表征和潜在HCC驱动基因的鉴定

 

 

结论

本文使用10x scRNA-seq来鉴定和表征HCC患者的CTC,其原理验证研究证明了转录组分析的优势,可以很好地检测CTC检测HCC异质性的潜在作用及检测HCC驱动基因的能力,这将有助于制定患者的治疗干预方案。

 

参考文献

Delia D’Avola,Carlos Villacorta-Martin, Sebastiao N. Martins-Filho,et al.High-density single cell mRNA sequencing to characterize circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma. Scientific Reports.2018,08.

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