晶诚所至 生命所能

Engage to Life Energy

 
10x 案列解读|单细胞表达谱测序揭示miRNA对靶基因的逐级调控
发布日期:2018-09-30浏览:

Rzepiela A J等研究人员采用10x单细胞测序和细胞群mRNA-seq来表征miRNA对单个细胞中靶基因的调节作用。研究结果2018年8月发表于Molecular systems biology杂志,IF:9.75。

                                                                                    

本研究数据首次揭示了内源miRNA整个网络对靶基因的调控参数;证明miRNA与靶基因表达相关,同时增加了跨细胞的各个靶基因表达可变性。该方法可推广至其他miRNA和转录后调节因子,以提高对单个细胞类型中基因表达动力学的理解。

 

 

 

 

 

 

研究思路

 

 

 

 

 

 

主要研究内容

 

 

1. 研究miRNA表达对个体细胞转录组的影响系统

 

miRNA靶基因广泛用于研究miRNA依赖性基因调控。本文使用人胚肾(HEK)293细胞系,其中hsa-miR-199a的表达miR前体和绿色荧光蛋白(GFP)可以由来自pRTS1游离载体的多西环素同时诱导(图1A)。

 

使用相关细胞系i199-KTN1来评估miRNA靶基因灵敏度参数的再现性。 通过RT-PCR发现不同浓度多西环素诱导的细胞群中hsa-miR-199a-5p的表达和GFP mRNA的表达高度相关(图1B),表明GFP mRNA水平可作为miRNA水平的“代理”,用于研究miRNA靶基因对个体细胞中miRNA的调控。

 

诱导细胞(多西环素浓度:0-1 µg / ml),合并细胞在10x Genomics平台上(3280个i199和3143 个i199-KTN1细胞)进行mRNA测序;从未诱导的i199细胞和完全诱导的细胞(1μg/ ml)进行大量mRNA测序。

 

从43%的i199细胞中捕获GFP mRNA,其中平均GFP mRNA表达用TPM表示(图1C);通过对没有GFP mRN 单细胞(SC)或通过非诱导细胞群(CP)大量测序推断mRNA表达水平高度相关(图1D);与没有GFP表达的细胞相比,具有高GFP mRNA表达(> 6.8 TPM)的细胞中两种miRNA的前100个MIRZA-GC预测靶基因的表达显著降低(0 TPM,图1E);预测靶基因的表达与GFP mRNA水平的增加同时降低,进一步表明GFP mRNA是个体细胞中miRNA表达的良好代表;miRNA诱导靶基因表达变化,从强诱导和未诱导细胞的大量或单细胞测序推断出显著相关(图1F)。最终结果表明:该系统可用于进一步分析单细胞中miRNA依赖性基因调控。

 

图1.实验系统的设计和表征

 

 

2.在不同miRNA水平的细胞表达可推断单个靶基因对miRNA调节的敏感性

 

不同miRNA靶基因以不同的miRNA浓度响应,并且仅miRNA浓度在该靶基因相关范围内的细胞可用于推断反应的形状(图2A-2C)。从这些计算机数据推断的游离miRNA水平显示,只有当总miRNA水平足够高以占据所有可用靶位点时,游离miRNA才会如预期那样积累(图2D);目标特定输入和恢复参数之间的相关性处于由模拟数据中噪声水平设定的上限(图2E);从两个模拟中恢复的参数仅在模拟细胞中添加到目标表达水平的测量误差不同(图2F)。

 

图2.验证从单细胞数据推断目标灵敏度的方法

 

 

3. 有限数量的靶基因对miRNA诱导表现出高度敏感性

 

从实验数据预测miRNA靶基因的灵敏度,对每个miRNA选择具有最高预测分数的300个MIRZA-GC为预测目标。使用log2 GFP表达为0 TPM的细胞(i199和i199-KTN1细胞分别为1875和1629个)来推断目标水平T0i;当miRNA不表达时,细胞具有超过6.8 TPM GFP(216个细胞个i199和205个i199-KTN1)以在miRNA浓度饱和时推断靶基因水平T1i;对于hsamiR-199a-5p和hsa-miR-199a-3p miRNA,独立于两种细胞系推断的靶基因参数显著相关(图3D、3E)表明结果的稳健性;最广泛用于验证计算目标预测的度量是预测目标在强miRNA诱导时经历的表达变化(图3F)。

 

图3.各个靶基因对miRNA表达变化调控的参数

 

 

4. 对miRNA靶基因 ceRNA 功能的影响

 

为评估结果对于竞争性内源RNA的普遍性影响,再次使用计算模型和现实的KM值探索一个miRNA靶基因对其他所有目标表达的影响。

 

ceRNA只是RNA在细胞中的一种表达,并且对于针对细胞中其他RNA确定的范围内绝大多数参数值,预测ceRNA引起非常低表达变化如图4,发现具有低KM高表达的ceRNA可以诱导低和较高KM靶基因的上调;只有当ceRNA具有超高转录率并与miRNA复合不会衰变时,才能实现大于百分之几的其他靶基因的显著上调。

 

另一方面,如果ceRNA具有高KM,则对其他靶基因表达的影响可以忽略不计。最终结果表明:迄今为止观察到ceRNA是高度表达的转录物,其相对抗降解。然而,考虑到转录物要满足多种限制以能起到ceRNA(非常高的转录或稳定性)的作用,这种调节模式比较罕见。

 

 

图4.不同类型的miRNA靶基因对诱导ceRNA的预测反应。

 

 

 

结论

 

 

 

细胞群中miRNA和GFP mRNA的绝对定量表明两种RNA的表达与多西环素诱导的反应高度相关,使用GFP mRNA作为miRNA的代表;直接测量mRNA测序细胞中miRNA的表达可能会进一步提高模型结果的准确性,期望该技术在不久的将来可用。

 

研究中推断的miRNA靶基因参数将有助于更好地理解包含许多竞争性miRNA靶基因网络动态。此外,该方法可以扩展到mRNA稳定性的RNA结合蛋白调节剂以及其他类型的调节剂如转录因子。

 

 

参考文献:

 

Andrzej J Rzepiela, Souvik Ghosh, Jeremie Breda,et al. Single-cell mRNA profiling reveals the hierarchical response of miRNA targets to miRNA induction. Molecular Systems Biology,2018,8:1-15.

上一条:无
下一条: 10x scRNA-seq 助力NeP研究,癌症治疗靶点发现新方向
返回
网站地图 | 法律声明 | 联系我们

地址:上海市漕河泾开发区漕宝路401号3号楼4B 电话:021-60901207/60901208
晶能生物技术(上海)有限公司 Copyright 2012 Genergy Inc. 沪ICP备10017363号

友情链接: