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Dr.cell专栏 | 如何选择跟你最搭的10x单细胞转录组测序应用?
发布日期:2019-07-19浏览:
相信通过前两期的介绍,大家对单细胞转录组的测序及其可使用的平台已经有所了解。随着研究越来越精细及人类细胞图谱计划的推出,单细胞转录组的研究越来越热,是近几年值得重点关注的研究方向。
 
今天Dr. cell就为大家重点介绍一下10x Genomics单细胞测序平台及其应用。(小身材大味道!)
 
10x Genomics单细胞测序平台凭借其高通量、高性能以及更低的单细胞测序成本得到了广泛的应用,是目前应用相对较多的单细胞测序平台。截止2019年6月,累计已发表文献近400篇,其中近一半的文献涉及肿瘤和免疫等重要的科学领域。当然由于其通量高等优势,也适用于神经细胞,生殖细胞,干细胞等复杂原代细胞的研究。
 
虽然10x单细胞应用领域很多,但如何与自己的课题有效结合呢?
 
接下来就结合文献为大家重点介绍10x Genomics单细胞转录组测序及其应用,让大家能尽快get到与自身课题的契合点,得到更精细更有意义的研究结果。(文章较长,但一定要耐心读完,我相信认真的你定会有收获)
 
Chromium™ Single Cell Gene Expression Workflow
 
 
10x Genomics单细胞转录组测序
 
首先我们回顾一下10x Genomics单细胞转录组平台的原理及特点。10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution是10x公司最早推出的单细胞产品,也是目前10x所有产品中应用最广泛的技术。
 
其技术原理可以概括为两个部分:
 
第一,特殊设计的Gel Beads(共有130多万种)上长满了寡聚核苷酸链,包含10x Barcode和UMI等序列信息,每一种Gel bead仅带有一种Barcode,用来标记单细胞的mRNA。
 
第二,双十字微流控芯片可以保证在一个油滴包裹的单细胞微反应体系中仅有一个细胞和一种beads,反转录之后每个细胞的cDNA都会带上特有Barcode,通过区分不同的Barcode来实现单细胞转录组的研究。
 
 
2018年底,10x将单细胞表达谱产品升级到V3版本。这次升级集合了试剂&分析软件的双重优化,大大提高了检测灵敏度,可以检测到更多的细胞和更多的基因表达。此外,通过feature barcoding技术,能在检测mRNA表达的同时检测细胞表面蛋白的表达和CRISPR干扰,适用于更广泛的科研需求。
 
就在这两天,我还得到最新消息,公司新到的4台10x仪器以及3'转录组测序、V(D)J测序、scATAC测序的试剂和芯片都已全面升级(Next GEM),(老的仪器当然也会升级啦!),未来,10x在单细胞方面的实验性能将会更加卓越。
 
10x Genomics单细胞转录组的应用
 
对于一项新技术来说,了解只是第一步,关键在于技术的实用性。如果无法与自己的研究挂钩,再新再高级的技术也不值得关注。接下来进入正题:10x Genomics单细胞转录组应用。希望对大家的研究有所启发。
 
10x单细胞转录组目前适用于各种存在异质性细胞的研究,且其也可用于不同物种的研究,包括植物。那具体通过单细胞转录组测序可以干些什么呢?构建细胞图谱,鉴定稀有细胞群,发育及分化轨迹的绘制,发现新细胞及新marker等等等,待我慢慢道来!
 
1. 构建细胞图谱
 
10x单细胞转录组推出之后,早期发表的文献主要与细胞图谱的构建相关。鉴于其细胞高通量的优势,这也是最容易想到的应用方向。因为传统的方式虽然可以鉴定器官或组织中的部分细胞类型,但无法一次鉴定出所有细胞类型。通过10x平台可以一次研究某一器官或组织中所有的细胞类型,从而构建完整的细胞图谱。但也因为这是最容易想到的研究方向,所以研究的也比较多了,大量的器官或组织图谱都已经被构建,从这个方向考虑就需要挖掘更新的研究点。例如,去年发表在Nature medicine关于肺癌的一项研究[1],就通过对19个肺癌和癌旁组织进行单细胞分析,鉴定了52种基质细胞和12种癌细胞,从而首次绘制了完整的肺癌细胞图谱。
 
 
2. 鉴定细胞群中稀有的细胞类型
 
鉴定细胞群中稀有的细胞类型是10x Genomics官方推荐的一个应用方向。为了论证10x单细胞转录组技术可用于鉴定稀有的细胞类型,10x公司做过一个demo实验,分别将B细胞和T细胞以9:1, 99:1和199:1的比例混合后进行单细胞转录组测序,结果通过分析能将低比例的细胞鉴定出来。当然只看官方的数据不够有说服力,因为其细胞类群并没有那么复杂。
 
去年8月,发表于cell metabolism上的关于脂肪重塑研究的文章中证明了其在稀有细胞类型鉴定中的应用[2]。该研究发现了占比非常低的一类增殖分化的干细胞(0.4% in control,1.5% in case)可能是脂肪重塑的重要机制,并在文中写到"These data demonstrate the power of scRNA to identify very small numbers of proliferating/differentiating cells that might be missed in bulk RNA profiling and histological analysis."如果关注复杂细胞群中稀有且重要的细胞类型,不妨考虑做单细胞转录组测序。另外,疾病发病或药物处理的分子机制探究,也可以考虑做单细胞转录组测序,寻找重要且稀有细胞的作用。
 
 
3. 绘制细胞发育分化的轨迹
 
人体所有细胞都是由原始的干细胞分化而来的,未分化的细胞如何选择他们最终命运,并逐步分化为成熟的体细胞,尚未研究的非常透彻。通过单细胞转录组测序,可以将不同发育分化时期的细胞鉴定出来,记录细胞分化过程中基因表达谱的动态变化,实现可视化的细胞发育分化轨迹,深度揭示细胞发育分化的过程。
 
目前的研究一般可以分为体外诱导分化和体内细胞的发育分化两个主要方向,且一直有相关研究的文章发表。今年4月在nature上就有一篇关于内胚层发育的文章[3]。此研究取了小鼠从囊胚期到妊娠中期的所有内胚层细胞进行单细胞转录组测序,从而构建了内胚层发育的时空图谱。针对这一方向,实验设计非常重要,在选取样本的时候一定要根据研究目的谨慎选择。
 
 
4. 发现新细胞及新细胞marker
 
对于科研来说,最终目标都是发现新的有意义的研究结果。而单细胞转录组测序,相对于传统研究方法来说,更利于发现新的细胞或新的marker,尤其是针对一些尚未研究透彻的器官、组织或细胞类型。新细胞的鉴定往往要比已知细胞要难,需要对自己研究领域非常的了解,并且可能需要花费更长的时间来摸索。当然也更有意义,一旦发现就是重要的研究成果。
 
目前该方向可涉及的研究领域还是非常多的,例如神经科学的研究。我们都知道大脑的构造非常复杂,大脑中的细胞类型至今尚未完全清楚,针对大脑不同功能区的研究就能找到新的发现。2019年3月,发表于Nature neuroscience的一项研究就是关于下丘脑外侧区域细胞多样性[4]。通过单细胞转录组测序,发现了许多已知和未知的神经元细胞类型,并用sc-qPCR和FISH实验对这些细胞的marker进行了验证。这篇文章的研究思路非常值得借鉴,很清晰的告诉了我们单细胞转录组能做哪些东西,及后续该如何验证单细胞转录组的结果。
 
 
 
10x单细胞转录组的应用当然不仅仅只是上面介绍的几点,这里只是抛砖引玉简单的介绍了一些可应用的方向。只要知道单细胞转录组能带给我们什么,就可以发散研究思路,尽早开启单细胞方面的研究,获得更多更有意义的研究结果。
 
期待大家与我更深一步的交流。欢迎联系咨询晶能生物当地销售!
 
参考文献
[1] Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment. Nat Med. 2018 Aug;24(8):1277-1289.
[2] Deconstructing Adipogenesis Induced by β3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metab. 2018 Aug 7;28(2):300-309.
[3] The emergent landscape of the mouse gut endoderm at single-cell resolution. Nature. 2019 May;569(7756):361-367.
[4] Single-cell transcriptomic analysis of the lateral hypothalamic area reveals molecularly distinct populations of inhibitory and excitatory neurons. Nat Neurosci. 2019 Apr;22(4):642-656.相信通过前两期的介绍,大家对单细胞转录组的测序及其可使用的平台已经有所了解。随着研究越来越精细及人类细胞图谱计划的推出,单细胞转录组的研究越来越热,是近几年值得重点关注的研究方向。
 
今天Dr. cell就为大家重点介绍一下10x Genomics单细胞测序平台及其应用。(小身材大味道!)
 
10x Genomics单细胞测序平台凭借其高通量、高性能以及更低的单细胞测序成本得到了广泛的应用,是目前应用相对较多的单细胞测序平台。截止2019年6月,累计已发表文献近400篇,其中近一半的文献涉及肿瘤和免疫等重要的科学领域。当然由于其通量高等优势,也适用于神经细胞,生殖细胞,干细胞等复杂原代细胞的研究。
 
虽然10x单细胞应用领域很多,但如何与自己的课题有效结合呢?
 
接下来就结合文献为大家重点介绍10x Genomics单细胞转录组测序及其应用,让大家能尽快get到与自身课题的契合点,得到更精细更有意义的研究结果。(文章较长,但一定要耐心读完,我相信认真的你定会有收获)
 
Chromium™ Single Cell Gene Expression Workflow
 
10x Genomics单细胞转录组测序
 
首先我们回顾一下10x Genomics单细胞转录组平台的原理及特点。10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution是10x公司最早推出的单细胞产品,也是目前10x所有产品中应用最广泛的技术。
 
其技术原理可以概括为两个部分:
 
第一,特殊设计的Gel Beads(共有130多万种)上长满了寡聚核苷酸链,包含10x Barcode和UMI等序列信息,每一种Gel bead仅带有一种Barcode,用来标记单细胞的mRNA。
 
第二,双十字微流控芯片可以保证在一个油滴包裹的单细胞微反应体系中仅有一个细胞和一种beads,反转录之后每个细胞的cDNA都会带上特有Barcode,通过区分不同的Barcode来实现单细胞转录组的研究。
 
2018年底,10x将单细胞表达谱产品升级到V3版本。这次升级集合了试剂&分析软件的双重优化,大大提高了检测灵敏度,可以检测到更多的细胞和更多的基因表达。此外,通过feature barcoding技术,能在检测mRNA表达的同时检测细胞表面蛋白的表达和CRISPR干扰,适用于更广泛的科研需求。
 
就在这两天,我还得到最新消息,公司新到的4台10x仪器以及3'转录组测序、V(D)J测序、scATAC测序的试剂和芯片都已全面升级(Next GEM),(老的仪器当然也会升级啦!),未来,10x在单细胞方面的实验性能将会更加卓越。
 
10x Genomics单细胞转录组的应用
 
对于一项新技术来说,了解只是第一步,关键在于技术的实用性。如果无法与自己的研究挂钩,再新再高级的技术也不值得关注。接下来进入正题:10x Genomics单细胞转录组应用。希望对大家的研究有所启发。
 
10x单细胞转录组目前适用于各种存在异质性细胞的研究,且其也可用于不同物种的研究,包括植物。那具体通过单细胞转录组测序可以干些什么呢?构建细胞图谱,鉴定稀有细胞群,发育及分化轨迹的绘制,发现新细胞及新marker等等等,待我慢慢道来!
 
1. 构建细胞图谱
 
10x单细胞转录组推出之后,早期发表的文献主要与细胞图谱的构建相关。鉴于其细胞高通量的优势,这也是最容易想到的应用方向。因为传统的方式虽然可以鉴定器官或组织中的部分细胞类型,但无法一次鉴定出所有细胞类型。通过10x平台可以一次研究某一器官或组织中所有的细胞类型,从而构建完整的细胞图谱。但也因为这是最容易想到的研究方向,所以研究的也比较多了,大量的器官或组织图谱都已经被构建,从这个方向考虑就需要挖掘更新的研究点。例如,去年发表在Nature medicine关于肺癌的一项研究[1],就通过对19个肺癌和癌旁组织进行单细胞分析,鉴定了52种基质细胞和12种癌细胞,从而首次绘制了完整的肺癌细胞图谱。
 
2. 鉴定细胞群中稀有的细胞类型
 
鉴定细胞群中稀有的细胞类型是10x Genomics官方推荐的一个应用方向。为了论证10x单细胞转录组技术可用于鉴定稀有的细胞类型,10x公司做过一个demo实验,分别将B细胞和T细胞以9:1, 99:1和199:1的比例混合后进行单细胞转录组测序,结果通过分析能将低比例的细胞鉴定出来。当然只看官方的数据不够有说服力,因为其细胞类群并没有那么复杂。
 
去年8月,发表于cell metabolism上的关于脂肪重塑研究的文章中证明了其在稀有细胞类型鉴定中的应用[2]。该研究发现了占比非常低的一类增殖分化的干细胞(0.4% in control,1.5% in case)可能是脂肪重塑的重要机制,并在文中写到"These data demonstrate the power of scRNA to identify very small numbers of proliferating/differentiating cells that might be missed in bulk RNA profiling and histological analysis."如果关注复杂细胞群中稀有且重要的细胞类型,不妨考虑做单细胞转录组测序。另外,疾病发病或药物处理的分子机制探究,也可以考虑做单细胞转录组测序,寻找重要且稀有细胞的作用。
 
3. 绘制细胞发育分化的轨迹
 
人体所有细胞都是由原始的干细胞分化而来的,未分化的细胞如何选择他们最终命运,并逐步分化为成熟的体细胞,尚未研究的非常透彻。通过单细胞转录组测序,可以将不同发育分化时期的细胞鉴定出来,记录细胞分化过程中基因表达谱的动态变化,实现可视化的细胞发育分化轨迹,深度揭示细胞发育分化的过程。
 
目前的研究一般可以分为体外诱导分化和体内细胞的发育分化两个主要方向,且一直有相关研究的文章发表。今年4月在nature上就有一篇关于内胚层发育的文章[3]。此研究取了小鼠从囊胚期到妊娠中期的所有内胚层细胞进行单细胞转录组测序,从而构建了内胚层发育的时空图谱。针对这一方向,实验设计非常重要,在选取样本的时候一定要根据研究目的谨慎选择。
 
4. 发现新细胞及新细胞marker
 
对于科研来说,最终目标都是发现新的有意义的研究结果。而单细胞转录组测序,相对于传统研究方法来说,更利于发现新的细胞或新的marker,尤其是针对一些尚未研究透彻的器官、组织或细胞类型。新细胞的鉴定往往要比已知细胞要难,需要对自己研究领域非常的了解,并且可能需要花费更长的时间来摸索。当然也更有意义,一旦发现就是重要的研究成果。
 
目前该方向可涉及的研究领域还是非常多的,例如神经科学的研究。我们都知道大脑的构造非常复杂,大脑中的细胞类型至今尚未完全清楚,针对大脑不同功能区的研究就能找到新的发现。2019年3月,发表于Nature neuroscience的一项研究就是关于下丘脑外侧区域细胞多样性[4]。通过单细胞转录组测序,发现了许多已知和未知的神经元细胞类型,并用sc-qPCR和FISH实验对这些细胞的marker进行了验证。这篇文章的研究思路非常值得借鉴,很清晰的告诉了我们单细胞转录组能做哪些东西,及后续该如何验证单细胞转录组的结果。
 
10x单细胞转录组的应用当然不仅仅只是上面介绍的几点,这里只是抛砖引玉简单的介绍了一些可应用的方向。只要知道单细胞转录组能带给我们什么,就可以发散研究思路,尽早开启单细胞方面的研究,获得更多更有意义的研究结果。
 
期待大家与我更深一步的交流。欢迎联系咨询晶能生物当地销售!
 
参考文献
[1] Phenotype molding of stromal cells in the lung tumor microenvironment. Nat Med. 2018 Aug;24(8):1277-1289.
[2] Deconstructing Adipogenesis Induced by β3-Adrenergic Receptor Activation with Single-Cell Expression Profiling. Cell Metab. 2018 Aug 7;28(2):300-309.
[3] The emergent landscape of the mouse gut endoderm at single-cell resolution. Nature. 2019 May;569(7756):361-367.
[4] Single-cell transcriptomic analysis of the lateral hypothalamic area reveals molecularly distinct populations of inhibitory and excitatory neurons. Nat Neurosci. 2019 Apr;22(4):642-656.
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