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Dr.cell专栏 | 大规模单细胞转录组测序平台
发布日期:2019-07-09浏览:
估计大家经过我前面的介绍,都对单细胞测序所了解了,但现在市面上有这么多测序平台,到底哪个更适合我的研究呢?
 
接下来的内容,将就五个国内外研究机构使用的“大规模单细胞测序平台”,一一解析如下问题(深度解析,文章略长):
 
10x Genomics Chromium™系统
Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution
BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System
Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统
WaferGen ICELL8 Single-Cell System
 
它们各自的性能如何呢?
有应用领域的差别吗?
每个平台都有什么优缺点呢
 
1. 10x Genomics Chromium™系统
 
10x Genomics公司于2016年2月推出10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution,实现在单细胞水平进行高通量基因表达谱检测,对复杂细胞群深入分析,表征单个细胞的表达谱,避免单个细胞的异质性生物学信息被大量细胞的均质化掩盖。
 
经过3年的产品更新,目前10x Genomics Chromium™系统不仅可应用于单细胞转录组方向,还可以进行单细胞免疫谱分析、单细胞ATAC-seq、单细胞CNV分析、Linked-read基因组重测序、基因组denovo分析以及空间转录组分析。
 
(10x-product-family, 来源10x Genomics官网)
 
10x Chromium™单细胞测序的技术原理类似于Drop-seq,技术核心是油滴包裹的凝胶珠(Gel Bead-In-Emulsions, GEM)。
▶ GEM形成过程
 
其利用微流控芯片对细胞/细胞核/DNA片段进行精确区分,使每个GEM反应体系中仅有一个细胞/细胞核/DNA片段。将带有序列标签的Gel Bead、样本(大分子DNA片段、细胞、细胞核)和试剂预混液、油加载到各自的进样通道,通过微流体通道网络形成的“双十字”交叉系统,最终形成由油滴包裹的单细胞微反应体系GEMs。
 
(来源10x Genomics宣传资料)
 
▶ 10x Chromium™单细胞检测原理
 
10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution中的Gel Bead中上长满了寡聚核苷酸链,包含Barcode和UMI、测序接头和Poly(dT)序列。在每个油滴内,凝胶珠溶解,细胞裂解释放mRNA,通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA;液体油层破坏后,cDNA后续进行文库构建,使用Illumina测序平台对文库进行测序检测,即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。
 
(来源10x Genomics宣传资料)
 
10x Genomics单细胞转录组测序的应用领域,就目前基于该平台已发表文章来看,内容涉猎广泛,不同研究方向均有一定的应用储备。
 
 
评价:8.5min之内即可完成单细胞体系制备,高效获得500-80,000个细胞的捕获,单个样本细胞捕获率高达65%。与其他大规模单细胞分选平台相比,10x通量高,操作简单、快速,灵活性强,技术性能高,单个细胞成本低,可实现多样本混合。新更新的v3试剂可进行转录组-蛋白组联合分析、转录组-CRISPR联合分析。但是对细胞活性要求较高,大于80%;只能得到3’端的mRNA信息。
 
2. Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution
 
(该系统包含Illumina® Nextseq 500和Bio-Rad® ddSEQ™ Single-Cell Isolator,图片来源Bio-Rad官网)
 
2017年1月17日,Illumina公司和Bio-Rad实验室公司在JP摩根健康大会上发布了Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution。
 
原理:借助Bio-Rad的Droplet Digital™液滴分离技术,对单细胞进行隔离和编制条形码,完成单个细胞的捕获、扩增、表达谱建库,然后在Illumina NextSeq500仪器进行下游测序,从而获得单个细胞表达谱数据。
 
(来源:GEN_Oct0117_BioRad_DDTut_Final)
 
该系统还可以使用BaseSpace® 平台中的SureCell™ RNA Single-Cell App进行分析,在Illumina的云端基因组学计算环境中进行初级和中级数据分析,并使用FlowJo的SeqGeq™,研究人员能够鉴定和探索亚群和差异表达的基因,同时轻松生成可发表的图片。
 
Illumina®Bio-Rad®Single-Cell Sequencing Solution工作流程(来源Bio-Rad官网)
 
评价:操作简单、一次性可8个样本,每个样本可以得到500~10000个细胞,成本较低。但是,捕获效率低,仅为3%;只能得到3’端的mRNA信息。
 
3. BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System
 
(来源:BD-Rhapsody-Single-Cell-Analysis-System-Brochure)
 
BD Rhapsody™系统基于微流控芯片技术,可自动将细胞试剂和微珠以很高的精度装入微孔中,确保微孔间的互串扰限制在最低限度。
 
(来源:BD-Rhapsody-Single-Cell-Analysis-System-Brochure)
 
细胞悬液经注入孔注入后自然沉降到反应孔中,然后Beads 以相同方式由注入孔注入,即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。Beads 上的序列结构与 10x相似,可以捕获到游离 mRNA 的 polyA 尾实现单细胞反转录、扩增、建库,单次实验可制备100-10,000个单细胞文库。该系统具有成像系统,在细胞捕获后,可直观的看到细胞捕获数、细胞状态等信息。
 
评价:实现多样本混合捕获,微孔板的孔数高达22万个;具备成像系统,可观察细胞相关信息;可以实现转录组-蛋白组联合分析;可根据需求定制引物,将检测范围集中在目标基因,大幅降低后续测序成本。
 
4. Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统
 
(图片来源:http://cn.fluidigm.com/products/c1-system )
 
2012年6月13日,Fluidigm 在日本横滨举行的国际干细胞研究学会 (ISSCR ) 上发布了C1™ 单细胞全自动制备系统,是真正第一个实现商业化的平台。C1 系统基于Fluidigm创新的微流体技术,能够让研究者们快速可靠地分离单个细胞并进行分析。
 
 
原理:C1单细胞自动制备系统微流体技术,可以同时捕获多个单细胞(IFC:~96 cells;HT-IFC:~800 cells),在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程;然后BioMarkHD系统进行qPCR扩增,在几个小时内即可测试数以百计的单细胞中数百个基因的表达。
 
评价:分选单细胞之后可支持不同测序方法,可以获取到转录组的全长信息,但是通量低、单个细胞成本高。
 
5. WaferGen ICELL8® Single-Cell System
 
(图片来源:https://www.takarabio.com/products/automation-systems)
 
Wafergen公司开发了ICELL8 cx Single-Cell System单细胞分选平台基于微流控芯片的技术,利用WaferGen Smart Chip TE平台筛选细胞,5184个反应孔,可进行单细胞RNA测序样本的制备、扩增、表达谱建库测序、生物信息分析,可快速得到样本间的基因表达差异。
 
(ICELL8 single-cell RNA-seq workflow,来源:Goldstein et al. BMC Genomics (2017) 18:519)
 
评价:平台每次运行可分离500-1000个细胞,细胞的捕获只有效率30%,分选单细胞之后可支持不同测序方法,成本相对较低。但是,流程较繁琐,没有整合试剂,使用Takara试剂,需进行试剂优化。
 
放大招 | 五大平台直接比拼
 
现阶段,商业化的能直接购买使用的即以上5种平台,可以看出:
 
 
各个平台性能各有特色,实验中大家可根据实际需求综合考虑,选择最能满足试验需求的平台。大家如需要以上相关资料,欢迎在后台留言索取。
 
 
参考文献
 
1. 10x Genomics官网:https://www.10xgenomics.com/ 
2. Bio-Rad官网:http://www.bio-rad.com/zh-cn/category/single-cell-sample-preparation-for-ngs?ID=OKNW7Q15 
3. Jennifer Chew et al., High-Throughput Single-Cell RNA-Seq of Large Cells and Nuclei: Harnessing RNA-Seq to Create Gene Expression Profiles, Genetic Engineering & Biotechnology News, October 1, 2017.
4. BD官网:http://www.bdbiosciences.com/en-us , BD Rhapsody Single Cell Analysis System Brochure.
5. Fluidigm官网:http://cn.fluidigm.com/products/c1-system
6. takarabio官网:https://www.takarabio.com/products/automation-systems
7. Goldstein LD, Chen YJ, Dunne J, et al. Massively parallel nanowell-based single-cell gene expression profiling. BMC Genomics. 2017;18(1):519估计大家经过我前面的介绍,都对单细胞测序所了解了,但现在市面上有这么多测序平台,到底哪个更适合我的研究呢?
 
接下来的内容,将就五个国内外研究机构使用的“大规模单细胞测序平台”,一一解析如下问题(深度解析,文章略长,文末有彩蛋哦!):
 
10x Genomics Chromium™系统
Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution
BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System
Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统
WaferGen ICELL8 Single-Cell System
 
它们各自的性能如何呢?
有应用领域的差别吗?
每个平台都有什么优缺点呢
 
110x Genomics Chromium™系统
 
10x Genomics公司于2016年2月推出10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution,实现在单细胞水平进行高通量基因表达谱检测,对复杂细胞群深入分析,表征单个细胞的表达谱,避免单个细胞的异质性生物学信息被大量细胞的均质化掩盖。
 
经过3年的产品更新,目前10x Genomics Chromium™系统不仅可应用于单细胞转录组方向,还可以进行单细胞免疫谱分析、单细胞ATAC-seq、单细胞CNV分析、Linked-read基因组重测序、基因组denovo分析以及空间转录组分析。
 
(10x-product-family, 来源10x Genomics官网)
 
10x Chromium™单细胞测序的技术原理类似于Drop-seq,技术核心是油滴包裹的凝胶珠(Gel Bead-In-Emulsions, GEM)。
 
▶ GEM形成过程
 
其利用微流控芯片对细胞/细胞核/DNA片段进行精确区分,使每个GEM反应体系中仅有一个细胞/细胞核/DNA片段。将带有序列标签的Gel Bead、样本(大分子DNA片段、细胞、细胞核)和试剂预混液、油加载到各自的进样通道,通过微流体通道网络形成的“双十字”交叉系统,最终形成由油滴包裹的单细胞微反应体系GEMs。
 
(来源10x Genomics宣传资料)
 
▶ 10x Chromium™单细胞检测原理
 
10x Chromium™ Single Cell Gene Expression Solution中的Gel Bead中上长满了寡聚核苷酸链,包含Barcode和UMI、测序接头和Poly(dT)序列。在每个油滴内,凝胶珠溶解,细胞裂解释放mRNA,通过逆转录产生用于测序的带条形码的cDNA;液体油层破坏后,cDNA后续进行文库构建,使用Illumina测序平台对文库进行测序检测,即可一次性获得大量单细胞的基因表达数据。
 
(来源10x Genomics宣传资料)
 
10x Genomics单细胞转录组测序的应用领域,就目前基于该平台已发表文章来看,内容涉猎广泛,不同研究方向均有一定的应用储备。
 
肿瘤(肿瘤微环境、肿瘤细胞特征、循环肿瘤细胞、肿瘤耐药研究、肿瘤免疫治疗)
免疫
发育分化(神经系统发育、脑发育等)
细胞图谱
CRISPR
传染病
植物
 
评价:8.5min之内即可完成单细胞体系制备,高效获得500-80,000个细胞的捕获,单个样本细胞捕获率高达65%。与其他大规模单细胞分选平台相比,10x通量高,操作简单、快速,灵活性强,技术性能高,单个细胞成本低,可实现多样本混合。新更新的v3试剂可进行转录组-蛋白组联合分析、转录组-CRISPR联合分析。但是对细胞活性要求较高,大于80%;只能得到3’端的mRNA信息。
 
2Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution
 
(该系统包含Illumina® Nextseq 500和Bio-Rad® ddSEQ™ Single-Cell Isolator,图片来源Bio-Rad官网)
 
2017年1月17日,Illumina公司和Bio-Rad实验室公司在JP摩根健康大会上发布了Illumina® Bio-Rad® Single-Cell Sequencing Solution。
 
原理:借助Bio-Rad的Droplet Digital™液滴分离技术,对单细胞进行隔离和编制条形码,完成单个细胞的捕获、扩增、表达谱建库,然后在Illumina NextSeq500仪器进行下游测序,从而获得单个细胞表达谱数据。
 
(来源:GEN_Oct0117_BioRad_DDTut_Final)
 
该系统还可以使用BaseSpace® 平台中的SureCell™ RNA Single-Cell App进行分析,在Illumina的云端基因组学计算环境中进行初级和中级数据分析,并使用FlowJo的SeqGeq™,研究人员能够鉴定和探索亚群和差异表达的基因,同时轻松生成可发表的图片。
 
Illumina®Bio-Rad®Single-Cell Sequencing Solution工作流程(来源Bio-Rad官网)
 
评价:操作简单、一次性可8个样本,每个样本可以得到500~10000个细胞,成本较低。但是,捕获效率低,仅为3%;只能得到3’端的mRNA信息。
 
3BD Rhapsody™ Single-Cell Analysis System
 
(来源:BD-Rhapsody-Single-Cell-Analysis-System-Brochure)
 
BD Rhapsody™系统基于微流控芯片技术,可自动将细胞试剂和微珠以很高的精度装入微孔中,确保微孔间的互串扰限制在最低限度。
 
(来源:BD-Rhapsody-Single-Cell-Analysis-System-Brochure)
 
细胞悬液经注入孔注入后自然沉降到反应孔中,然后Beads 以相同方式由注入孔注入,即可在单个反应孔中捕获其中的细胞。Beads 上的序列结构与 10x相似,可以捕获到游离 mRNA 的 polyA 尾实现单细胞反转录、扩增、建库,单次实验可制备100-10,000个单细胞文库。该系统具有成像系统,在细胞捕获后,可直观的看到细胞捕获数、细胞状态等信息。
 
评价:实现多样本混合捕获,微孔板的孔数高达22万个;具备成像系统,可观察细胞相关信息;可以实现转录组-蛋白组联合分析;可根据需求定制引物,将检测范围集中在目标基因,大幅降低后续测序成本。
 
4Fluidigm C1™ 单细胞全自动制备系统
 
(图片来源:http://cn.fluidigm.com/products/c1-system )
 
2012年6月13日,Fluidigm 在日本横滨举行的国际干细胞研究学会 (ISSCR ) 上发布了C1™ 单细胞全自动制备系统,是真正第一个实现商业化的平台。C1 系统基于Fluidigm创新的微流体技术,能够让研究者们快速可靠地分离单个细胞并进行分析。
 
原理:C1单细胞自动制备系统微流体技术,可以同时捕获多个单细胞(IFC:~96 cells;HT-IFC:~800 cells),在同一张芯片上完成细胞捕获、裂解、逆转录及预扩增的全过程;然后BioMarkHD系统进行qPCR扩增,在几个小时内即可测试数以百计的单细胞中数百个基因的表达。
 
评价:分选单细胞之后可支持不同测序方法,可以获取到转录组的全长信息,但是通量低、单个细胞成本高。
 
5WaferGen ICELL8® Single-Cell System
 
(图片来源:https://www.takarabio.com/products/automation-systems)
 
Wafergen公司开发了ICELL8 cx Single-Cell System单细胞分选平台基于微流控芯片的技术,利用WaferGen Smart Chip TE平台筛选细胞,5184个反应孔,可进行单细胞RNA测序样本的制备、扩增、表达谱建库测序、生物信息分析,可快速得到样本间的基因表达差异。
 
(ICELL8 single-cell RNA-seq workflow,来源:Goldstein et al. BMC Genomics (2017) 18:519)
 
评价:平台每次运行可分离500-1000个细胞,细胞的捕获只有效率30%,分选单细胞之后可支持不同测序方法,成本相对较低。但是,流程较繁琐,没有整合试剂,使用Takara试剂,需进行试剂优化。
 
放大招
五大平台直接比拼
 
现阶段,商业化的能直接购买使用的即以上5种平台,可以看出:
 
BD Rhapsody™、Fluidigm C1™、WaferGen ICELL8®均通过微孔板芯片进行单细胞反应体系制备,实现细胞间的物理间隔;而10x Chromiun™则是通过“双十字通道芯片”,产生液滴包裹的单细胞反应体系,相比之下能检测更多细胞,并且对于细胞的直径接受度也更高(<40μm)。
 
细胞活力上,10x Chromiun™要求更高:>80%。因此在制备完单细胞悬液后,需要尽快上机制备单细胞文库,此时能及时预约到上门服务显得格外重要。
 
检测区域上,目前仅有Fluidigm C1™和WaferGen ICELL8®能检测mRNA全长,其余均只能检测3’端表达谱区域。
 
以上是对各平台的总结性概括,具体内容可查看下表。
 
各个平台性能各有特色,实验中大家可根据实际需求综合考虑,选择最能满足试验需求的平台。大家如需要以上相关资料,欢迎在后台留言索取。
 
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参考文献
 
1. 10x Genomics官网:https://www.10xgenomics.com/ 
2. Bio-Rad官网:http://www.bio-rad.com/zh-cn/category/single-cell-sample-preparation-for-ngs?ID=OKNW7Q15 
3. Jennifer Chew et al., High-Throughput Single-Cell RNA-Seq of Large Cells and Nuclei: Harnessing RNA-Seq to Create Gene Expression Profiles, Genetic Engineering & Biotechnology News, October 1, 2017.
4. BD官网:http://www.bdbiosciences.com/en-us , BD Rhapsody Single Cell Analysis System Brochure.
5. Fluidigm官网:http://cn.fluidigm.com/products/c1-system
6. takarabio官网:https://www.takarabio.com/products/automation-systems
7. Goldstein LD, Chen YJ, Dunne J, et al. Massively parallel nanowell-based single-cell gene expression profiling. BMC Genomics. 2017;18(1):519
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