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Dr. cell来啦!深入浅出解读单细胞转录组测序技术路线
发布日期:2019-06-21浏览:

hello,大家好。我是细胞博士。我有一个很洋气的名字Dr. cell。经过多年的摸爬滚打、潜心钻研,我终于学成归来。很高兴在这个庄严、隆重的场合闪亮登场。

多年图书馆沉浸式学习、实验室不分日夜的操作实践、生信分析代码的鏖战,我最最最富有的就是学习笔记、研究经验。对于“单细胞研究”,我很自信。

当然,我是一个“大肚”的人,未来我会慢慢将我“单细胞研究”学习笔记传授给大家。

第一次跟大家见面,我肯定不会空手而来。对细胞“博古通今”的我,先带来一个重磅:单细胞研究最热门的方向——单细胞转录组测序。看完下面我的笔记,我相信你肯定会对单细胞转录组测序的技术路线有一个成熟的把握。

 

单细胞研究您该知道的事~

人们对细胞的认识可以从1665年Robert Hooke发现细胞说起,科学家们对植物细胞和动物细胞展开了进一步的观察研究,并由Schleiden和Schwann最早创立细胞学说,直到19世纪中期该学说才得以完善。从这些研究结论中我们认知到细胞是生物体结构和功能的基本单位,每个细胞有独特的表型和生物学功能,细胞之间存在异质性,这也正是细胞作为生命科学研究的最基本单位的意义所在。

 

相同或不同组织、器官、系统中的细胞均存在异质性,这不仅体现在形态结构上,由于细胞的命运由遗传物质决定,其本质差异更体现在基因组、转录组、表观组等层面,因此可对不同组学展开单细胞研究,其优势在于能够避免Bulk样本的均质化掩盖单细胞的异质性,可以在单细胞水平深入探索健康生理和疾病异常下的细胞状态,以了解生物体的功能机制和发现更为有效的疾病治疗方法。

 

 

近几十年来,人们一直围绕单细胞进行研究,2013年,单细胞DNA测序和单细胞RNA测序曾被Nature Methods评为年度技术;2016年,大型国际合作项目“人类细胞图谱计划”(The Human Cell Atlas)启动,该项目根据独特的分子信息(如基因表达)对所有人类细胞种类进行定义,并将这些信息与传统的细胞学表述(如位置和形态)相关联,在全球掀起了单细胞研究的热潮,尤其单细胞转录组测序是目前单细胞研究最热门的方向。

 

 

 单细胞转录组测序



最早的单细胞组转录组技术只能检测单个细胞中的少数基因,细胞和基因的通量都比较低[1],后来通过结合芯片技术使细胞和基因的通量有所提升[2,3],直到2009年汤富酬[4]将单细胞转录组与高通量测序结合时,基因检测通量才大大提升,比芯片能检测更多的转录本,这也是单细胞转录组测序的雏形,在此基础上细胞分离技术和检测技术等不断得到提升改进,逐渐发展出现今比较成熟的技术。

单细胞转录组测序的技术路线大致为:

 

 

1.细胞分离

单细胞转录组研究面临的一大技术难题是如何提升细胞通量,关键的技术突破是需要实现自动分离单细胞、从单个细胞中非定向扩增整个转录组、提升并行处理多个细胞的能力。从最初的人工手动分离如显微吸取法、激光显微切割法等,发展到自动化的集成流体电路、液滴微流控技术等,细胞通量从个位数跳跃到数万个细胞的数量级。分离得到的单细胞需要进一步保证拥有各自独立的微反应体系,比如微孔板利用孔间隔离、液滴微流控利用油滴包裹单细胞隔离。

 

 

 

2.单细胞标记

细胞标记是利用十多个碱基的核苷酸序列作为标签(Barcode),在单细胞微反应体系的逆转录过程中进行标记,同一个细胞内的所有转录本标记上相同的Barcode,这样在后续建库时能够混合操作,在数据分析层面也能够达到区分单细胞表达谱数据的目的,如STRT-seq[5]、CEL-seq[6]等。随着技术的升级,后来又引入了单细胞转录本UMI(Unique Molecular Identifier)标记,以解决PCR Bias对基因表达定量的影响,使基因定量更加精确,如CEL-seq2[7]、Drop-seq[8]。逆转录-标记之后得到cDNA链,进一步基于PCR或IVT技术对cDNA扩增以达到二代测序的要求。

 

 

3.基因检测

对于检测的基因类型,目前单细胞转录组测序是通过Poly(dT)捕获携带Poly(A)的RNA分子,主要检测mRNA和很少部分的lncRNA,检测的基因区域范围一般是3’ 端50-100 bp左右,对中高表达的基因较为敏感。与Smart-seq2相比,Smart-seq2虽然能够检测mRNA的全长信息、较多的基因数目,但是细胞通量低、成本较高,不适合大规模的单细胞研究。Smart-seq2与STRT-seq、CEL-seq、Drop-seq等技术相比能够检测mRNA的全长信息,获得较多的基因数目,但该技术仍存在细胞通量低、成本较高的缺点,不适合大规模的单细胞研究。

 

 

4.数据分析

高通量单细胞转录组测序在数据分析上有一定的套路可循:

 

当然,除此基本的分析套路之外还可以展开其他更为高级、个性的数据分析。 

综上,在众多研究者们的共同努力下,人们逐渐意识到研究单细胞的价值所在,形成了越发成熟的技术路线:从细胞分离→细胞标记→基因检测→数据分析。

 

参考文献

[1] Lambolez, B. et al. Neuron 9, 247–258 (1992). PMID: 1323310

[2] Tietjen, I. et al. Neuron 38, 161–175 (2003).

[3] Kurimoto, K. et al. Nucleic Acids Res. 34, e42 (2006).

[4] Tang, F. et al. Nat. Methods 6, 377–382 (2009).

[5] Islam S. et al. Genome Res. 2011 Jul;21(7):1160-7.

[6] Hashimshony T. et al. Cell Rep. 2012 Sep 27;2(3):666-73.

[7] Hashimshony T. et al. Genome Biol. 2016 Apr 28;17:77. 

[8] Evan Z. et al. Cell. 2015 May 21;161(5):1202-1214.

我的笔记还算详细吧。单细胞转录组测序的路线熟悉了吗?欢迎大家读完后与我探讨。

 

 

Dr. cell

2019-6-21

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