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10x 案例解读丨细胞发育的“黑匣子”——科学家设计出新的方法来追踪细胞重编程
发布日期:2019-02-20浏览:

125日,Nature在线发表了来自华盛顿大学医学院的科学家(Samantha A. Morris课题组)的研究Single-cell mapping of lineage and identity in direct reprogramming,该论文中报道了开发出的一种新工具,被称为发育细胞的黑匣子”, 这种称为“CellTagging”的谱系示踪工具结合单细胞RNA测序技术可以描绘出细胞从一种类型转变向另一种细胞类型的变化途径

 

 

 

研究者利用lentivirus 将细胞中插入“barcode”,这样不同的细胞中表达不同的barcode组合,当细胞分裂时,这种独特的barcodes会在所有后代中传递下去。利用这种不同的“CellTag” 表达组合,可以追踪细胞和它们的后代,这种细胞标记方法可以平行捕捉到细胞克隆历史和细胞类型。

 

研究者把成纤维细胞诱导分化为内胚层前体细胞。在28天细胞重编程过程中,新的barcodes不同时间点会被顺次加入。这些细胞样品会被单细胞RNA测序分析细胞所发生变化。CellTagging工具可以允许研究者构建出不同水平的细胞树,这样成功重编程的细胞可以沿着路径被追踪回到它们的早期祖先

 

 

研究思路

 

 

 

 

主要研究内容

 

1. CellTagging跟踪细胞克隆历史

 

CellTagging是一种基于慢病毒,通过可遗传的条形码组合对各个细胞进行独特标记。 CellTag高度表达且易在每个单细胞转录组中捕获,从而能够记录克隆历史随时间的变化与细胞身份的识别(图1a)。通过用相同的CellTag文库标记两个独立的生物学重复进一步支持CellTagging在细胞中提供独特的、可遗传的标记的实用性,允许纵向跟踪克隆关系,具有高度的可信度(图1b1c

 

CellTagging应用于成纤维细胞直接重编程为iEP,其由转录因子FOXA1HNF4α(分别由Foxa1Hnf4a编码)的逆转录病毒过表达驱动。为了实现谱系重建,设计一种顺序CellTagging方案,其中用初始CellTag文库-CellTagMEF转导成纤维细胞在转录因子递送的3天后进行第二个文库(CellTagD3)的标记,然后13后再进行标记CellTagD1328天的时间中每3-7天收集细胞,共捕获了104887个单细胞用于Drop-seq10x Genomics单细胞测序(图1d下游分析侧重于使用10x Genomics平台捕获的数据(850101e

 

图1.CellTagging:克隆跟踪应用于重新编程

 

 

2.并行捕获重编程和克隆动力学

 

28天重编程过程分成13cluster99%的细胞检测到表达CellTag在所有的时间点均检测CellTagMEF表达,CellTagD3是从第6天检测到且从第15天检测CellTagD13(图1e研究重编程的动力学,追踪iEP的出现,将个体细胞身份评分为起始细胞类型和靶细胞类型的一部分,揭示从重编程的第6天开始逐步获得iEP身份。将同一性得分投射到t-SNE图上将iEP定位于cluster2编程第21天和第28天一致(图1f1g)。这些结果表明许多细胞启动重编程,但很少完成向iEP的转变。使用这些标志物的表达及细胞身份评分将该过程分为4个阶段:成纤维细胞,早期转变,转变和重编程(图1g2b

 

在重编程期间,观察到广泛的克隆生长:到第28天,CellTagMEF克隆达到每克隆47±22个细胞的平均大小以相似的速率扩增,首先从第6天检测到CellTagD3克隆,而较小的克隆来自CellTagD13标记(图3a3b

 

 

图2. 基于mRNA和蛋白质表达的cluster身份

 

 

图3.跟踪重编程和构建谱系树的克隆动态

 

 

3.谱系和重新编程轨迹重建

 

顺序CellTagging重建谱系树和重编程轨迹。源自一个CellTagMEF克隆的代表性谱系,其分CellTagD3CellTagD13后代(图3c。为了可视化克隆相关细胞的分布,使用等高线绘图结合t-SNE图,揭示属于同一谱系克隆的重叠关系,支持克隆相关细胞在转录上相似(图3d)。从这些分析中观察到许多谱系中iEP的富集或消耗,为了量化这一点,在重新编程的后期阶段重新聚类细胞,提供高覆盖率的克隆信息在该子集内,8%的细胞被分类为完全重编程的iEP(图4a);发现24iEP耗尽的克隆,其中不到3%的细胞被归类为iEPs(图4b

 

iEP富集和iEP耗尽的克隆在等高线图上明显分离,表明存在离散的重编程轨迹这些轨迹揭示了第21天的分叉,当重编程克隆通过cluster67转变时,出现28天的重编程成功状态另外,这些cluster绕过iEP耗尽的轨迹,在第28天进入重编程死胡同状态(图4c-4e)。早在第6天,这些两条途径似乎植根于不同的转录状态,表明它们在重编程过程的早期建立的。

 

图4.映射重编程轨迹和细胞命运

 

 

4.Mettl7a1可以提高重编程效率

 

研究不同重编程路径的分子特征,比较重编程和死胡同轨迹之间的细胞,沿着重编程轨迹,iEP身份分数随时间逐渐增加,部分成纤维细胞的同一性代表重编程进入了僵局(图5a)。比较重编程和死胡同两种轨迹基因表达的差异,发现成功重编程途径高表达经典内胚层发育信号,如WntIgf2HGF死胡同途径的细胞中成纤维相关基因会被重新活化(图5b5c。此外,发现一种可能的甲基转移酶Mettl7a1与重编程成功途径相关,在重编程诱导分子中加入Mettl7a1可以提高重编程效率(图5d5e。这些结果表明利用这种谱系追技术很好揭示出了直接重编程的动态过程

 

 

图5.重编程轨迹的分子标志

 

 

讨论

 

本文开发并验证组合索引策略CellTagging,它可以在单细胞分辨率下同时分析克隆历史和细胞身份。对Foxa1-Hnf4a介导的直接谱系重编程到iEP的纵向解剖揭示了两种不同的转换轨迹:一种导致成功的重编程,一种导致死胡同状态。观察到直接谱系重编程和诱导多能性之间的强烈相似性还发现一种可能的甲基转移酶Mettl7a1与重编程成功途径相关,在重编程诱导分子中加入Mettl7a1可以提高重编程效率。

 

CellTagging工具不仅能详细揭示出直接重编程过程,有助于提高重编程效率,对再生医学发展有很重要意义。CellTagging也可以应用于肿瘤研究,可以记录正常细胞怎样走入错误的途径转化为肿瘤细胞。

 

参考文献

Brent A. Biddy, Wenjun Kong, Kenji Kamimoto, et al. Single-cell mapping of lineage and identity in direct reprogramming.Nature.20181205. doi: 10.1038/s41586-018-0744-4(IF:41.577).

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