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基因组客户文章|神经障碍性疾病(PFBC)研究发现新致病基因
发布日期:2018-09-30浏览:

福建医科大学附属第一医院神经内科陈万金教授、王柠教授团队与中国科学院神经科学研究所熊志奇团队,近日发现原发性家族性脑钙化症(Primary Familial Brain Calcification,PFBC)新的致病基因MYORG。研究成果于6月14日在线发表于《Neuron》杂志,IF:14.024晶能生物有幸参与了部分家系样本的外显子测序工作。下面一起来解读下高分文章,你懂的~~~

 

 

 

MYORG上双等位基因突变导致常染色体隐性原发性家族性脑钙化症

 

 

 

本研究人员利用全外显子组测序(WES)分析、Sanger测序、连锁分析、RNA表达分析和小鼠模型的综合策略,表明肌生成调节糖苷酶(MYORG)(NCBI Gene57462; NM_020702)是PFBC的一个致病基因。

 

 

研究思路

 

 

 

 

研究内容

 

 

1、6个常染色体隐性PFBC家系中鉴定MYORG的双等位基因突变

 

为确定其他家系中的致病基因,首先选择近亲家系1进行WES分析。由于该家系符合隐性遗传模式,故筛选两个患者共有而正常人中没有的纯合突变;研究家系2发现也符合隐性遗传模式,筛选在患病兄弟中有而正常姐妹没有的,具有复合杂合或纯合变异的基因。该策略发现了两个基因,MYORG(c.1328G> A [p.W443 *]和c.103A> G [p.M35V])和SHISA6(两个错义变体)。

 

基因MYORG,位于染色体9p13.3上,编码714个氨基酸的蛋白质,是糖基水解酶31家族的成员。在该研究中鉴定的突变分布在MYORG基因的所有编码区中。9种与疾病相关的突变中有7种存在于内质网(ER)腔内片段中,其中3种位于糖苷酶结构域。剩余的突变p.M35V和p.W75 *分别定位于细胞质和跨膜片段(图1B)。

 


图1 、PFBC患者中检测到MYORG突变

 

MYORG为两个家系中共有的候选基因,然后对来自8个其他符合隐性遗传模式PFBC家系和3个不确定遗传模式家系的先证者进行Sanger测序。在另外四个先证者中鉴定出了MYORG中的纯合或复合杂合突变(图1A;表1)。对于其余七个家系,未检测到MYORG中任何疑似杂合或纯合的致病突变。

 

在上述六个家系中已鉴定出的9个MYORG突变中,三个是无义突变(p.W75 *,p.Q203 *和p.W443 *),两个是影响几个氨基酸的插入或缺失突变( p.116_117insLAFR和p.365_366delFD),四个是位于高度保守的结构域中的错义突变。所有这些突变在1000 Genomes Project和NHLBI GO外显子组测序项目(ESP)数据库中都不存在。在gnomAD中,这些突变不存在或极低频率下杂合(表1)。

 

 

 

2、MYORG在星形胶质细胞ER中的特异性表达

 

通过原位杂交(ISH)分析小鼠脑中Myorg表达,发现其分散于整个大脑中(图2A)。尤其是Myorg表达信号富集在小脑浦肯野细胞层(PCL)内的较小神经元胞体(Bergmann glia),提高了Myorg在星形胶质细胞中特异性表达的推测(图2B)。为验证结果,将Myorg ISH与标记星形胶质细胞(S100b,GFAP)、少突胶质细胞(Ng2)和周细胞(Pdgfrb)的方法结合起来,观察到在整个脑中Myorg原位信号与S100b免疫染色的显著共定位,包括大脑皮层(图2C)和小脑(图2D)。此外,在海马体中,Myorg原位信号也与GFAP免疫染色共定位(图2F,左)。

 

为进一步验证该结果,构建Myorg-GFP敲入小鼠,其中GFP编码序列直接插入内源Myorg基因的ATG密码子之后;发现所有表达GFP的细胞也表达S100b(图2E)。使用双链ISH发现Myorg和Ng2的表达仅部分重叠(图2F,中间)。相反,在Myorg和Pdgfrb之间未观察到共定位(图2F,右)。总之,以上结果首次表明Myorg在S100b +星形胶质细胞中特异性表达。

 

为研究MYORG蛋白的亚细胞定位,将GFP标记的MYORG质粒转染到Cos-7细胞和原代培养的人星形胶质细胞中。如在两种细胞类型中与ER标记蛋白Calnexin的共定位所示(图2G,右),GFP标记的MYORG主要定位于ER。仅观察到MYORG与高尔基标记蛋白GM130的部分共定位(图2G,左图)。结果表明MYORG可以调节脑中星形胶质细胞的ER中的蛋白质糖基化。

 

 

图2、Myorg在小鼠脑中的表达及MYORG在细胞中的亚细胞定位

 

 

3、MYORG的敲除导致小鼠脑内的钙化沉积

 

将靶向Myorg和Cas9 mRNA的sgRNA共同注射到C57BL / 6J受精卵中。通过对Myorg基因组DNA的PCR产物进行测序来进行founder小鼠的基因分型,并在插入到T-载体中之后通过每个等位基因的单克隆测序进一步验证基因型。

 

从2月龄开始可检测到钙化沉积物的存在。在2-8个月龄的对照或Myorg 基因敲除小鼠中未检测到明显的脑钙化。在9个月大的Myorg纯合子敲除小鼠的大脑切片中,其中茜素红、Von Kossa和H&E以及丘脑中的阿尔新蓝和高碘酸 - 希夫(PAS)染色呈阳性(图3A和3B中,上部),检测到双侧不规则钙化球体为球形或椭圆形,直径为10-50mm。相反,在该年龄的对照小鼠的脑中没有观察到钙化结节(图3B,下图)。

 

使用SEM-EDS分析结节的元素组成(图3C)。与周围组织中的碳相比,主要成分包括钙、磷和氧,表明大多数沉积的结节是磷酸钙(图3D)。Myorg基因敲除小鼠的钙化成分在元素组成上与人类相似。总之,结果表明Myorg 基因敲除小鼠脑中形成了磷酸钙沉积,进一步证实MYORG是PFBC的致病基因。

 

 图3、Myorg KO小鼠的脑钙化

 

 

结论

 

 

MYORG为一个常见的PFBC基因和PFBC的第一个常染色体隐性致病基因。此外,发现小鼠中Myorg mRNA在星形胶质细胞中特异性表达,将星形胶质细胞定义为参与脑钙化的细胞类型;Myorg基因敲除小鼠在大脑中形成钙沉积,符合PFBC患者的疾病表型。

 

 

参考文献:

 

 

Yao X P, Cheng X, Wang C, et al. Biallelic Mutations in MYORG Cause Autosomal Recessive Primary Familial Brain Calcification[J]. Neuron, 2018.

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