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转录调控研究的新武器——RAP
发布日期:2017-12-11浏览:
转录调控研究的新武器——RAP
RAP(RNA Antisense Purification)通过生物素标记的反义寡核苷酸探针来捕获其杂交的靶RNA,纯化后即可得到内源RNA及与之相结合的蛋白及核酸,这是研究RNA与DNA,RNA与蛋白,RNA与RNA相互作用的一种新方法。将RAP与测序或质谱技术结合,可以研究RNA与染色质的互作,鉴定与RNA相互作用的蛋白,在转录组层面上研究多种RNA间的转录调控关系,因此RAP可作为转录调控分子机制研究的新武器。
 
为了帮助大家更详尽的了解RAP技术,晶能小编精心准备了2篇关于RAP技术的文章,以RAP技术的发展为主线,从技术介绍到案例分析,为您全方位解读RAP应用。
 
RAP起源:lncRNA-染色质的相互作用
哺乳动物基因组编码数千种长链非编码RNA(lncRNA),这些lncRNA在细胞中有着重要的生物学功能。研究表明lncRNA可以通过识别基因组靶位点,与染色质发生相互作用来调控基因的表达,但机制尚不清楚。为此,加州理工学院Guttman博士团队开发出了一项新技术来研究lncRNA与染色质的相互作用。该技术即为RAP(RNA Antisense Purification),是一种应用生物素标记的反义寡核苷酸捕获目标RNA,从而研究与特定的RNA相互作用的DNA的技术。其主要技术流程如下: a. 针对目标RNA设计反义寡核苷酸探针,并合成探针;b. 细胞交联,溶解细胞,并打断DNA;c. 将生物素标记的探针与核酸复合物一起孵育;d. 洗脱、纯化之后,进行测序分析(图1)。
 
图1 RAP简要技术流程(Engreitz J M, Pandya-Jones A, McDonel P, et al.)
 
2013年science[1]杂志上,Guttman团队首次提出了RAP技术,并将其成功应用于目前研究最广泛的lncRNA——Xist的研究。众所周知,Xist是参与X染色体沉默的一种lncRNA分子,虽然对其功能已经非常了解,但Xist沉默X染色体的分子机制尚不明确。在该研究中,Guttman团队首先论证了RAP技术的可行性,随后用该方法探究了Xist在X染色体失活过程中的基因组定位及其迁移方式。结果发现,Xist可以识别三维基因组结构,通过改变染色质的空间结构来逐步迁移,并沉默整条X染色体。Guttman说,RAP令人激动的地方不仅仅是解释了Xist的运作机制,而是RAP技术也普遍适用于其他lncRNA研究。 
 
RAP发展:lncRNA-蛋白质的相互作用
在将RAP技术应用于lncRNA与染色质的相互作用的研究之后,Guttman团队并没有停下研究的脚步,他们与Broad研究所合作在nature上[2]发文,表明RAP技术同样适用于研究RNA与蛋白质的相互作用。新研究仍是探究Xist的分子机制,但重点放在了参与X染色体沉默的蛋白。为了找到与Xist直接作用的蛋白,研究人员对RAP技术进行了改进,主要体现在两方面:交联和纯化方式。交联由原来的化学交联改成了紫外交联,紫外交联能使RNA与蛋白之间形成稳定的共价连接。而纯化的方式则改成了去除非共价连接的变性条件,以便保留与RNA形成共价连接的蛋白。纯化得到RNA复合物之后,用定量质谱分析法就可以获得与RNA相互作用的蛋白(图2)。根据新建立的RAP-MS技术,该研究发现SHARP蛋白会与Xist发生直接的相互作用,且通过招募SMRT,激活HDAC3,抑制RNA聚合酶II的结合等方式沉默基因表达。
 
图2 RNA-蛋白质互作技术流程(McHugh C A, Chen C K, Chow A, et al.)
 
RAP延伸:RNA-RNA间的相互作用
随着转录调控研究的不断深入,RNA-RNA间的相互作用越来越受到重视,lncRNA、miRNA、circRNA及mRNA间可以通过ceRNA等相互作用机制调控生物体内复杂的生物学过程。RAP技术是否也可以应用于RNA-RNA间相互作用的研究呢?2014年发表于cell[3]的一篇文章论述了RAP技术在RNA间相互作用研究的应用。鉴于RNA间相互作用分为直接和间接作用两种,研究人员根据之前建立的RAP技术流程,开发出了三种新的实验流程:RAP-RNA[AMT], RAP-RNA[FA]和 RAP-RNA[FA-DSG]。这三种方法的主要区别在于交联方法的不同(图3): RAP-RNA[AMT]用的是AMT(4’-aminomethyltrioxalen),一种补骨脂素衍生物交联剂,可以使RNA与RNA间通过尿苷产生交联,适用于直接的RNA-RNA相互作用。RAP-RNA[FA]用的交联剂是FA(formaldehyde),可以同时交联RNA-RNA和RNA-蛋白,因此适用于同时研究RNA间的直接和间接相互作用。而RAP-RNA[FA-DSG]在FA的基础上,又添加了DSG(disuccinimidyl glutarate),一种强蛋白交联剂,更适用于RNA间通过多个蛋白连接的情况。这三种方法覆盖了所有RNA间相互作用的情况,研究者可以根据其研究目的选择最合适的方法来应用。
 
图3 三种RAP-RNA方法的区别(Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al.)
 
转录调控研究中,lncRNA-mRNA,miRNA-mRNA等通过序列互补直接结合的情况比较常见,因此RAP-RNA[AMT]的应用可能更为广泛。以U1 snRNA为例,RAP-RNA[AMT]的实验流程见图,4,主要步骤为:a. 设计并合成生物素标记的探针;b. 用AMT交联细胞;C. 裂解细胞,消化蛋白和DNA,片段化RNA;d. 将探针与RNA杂交;e. 洗脱RNA复合物,纯化RNA后进行测序分析。在RAP-RNA实验之后,通过qRT-PCR和二代测序等技术,可以研究与目标RNA相互作用的RNA,探究更深层的转录调控机制。
 
晶能生物最新推出RAP-RNA整体研究方案,可与全转录组测序技术相结合,在转录水平上研究lncRNA-mRNA,miRNA-mRNA,circRNA-mRNA等RNA间的相互作用,探究参与重要生命活动的潜在调控网络,助力您发表高分文章。
 
 
图4 RAP-RNA[AMT]的实验流程(Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al.)
 
下一期,小编将通过一个具体的案例来探究RAP在转录调控中的实际应用,该研究思路清晰、易于理解,可作为转录组相关研究课题设计的范本。敬请期待。
 
参考文献
[1] Engreitz J M, Pandya-Jones A, McDonel P, et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X chromosome[J]. Science, 2013, 341(6147): 1237973.
[2] McHugh C A, Chen C K, Chow A, et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3[J]. Nature, 2015, 521(7551): 232-236.
[3] Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites[J]. Cell, 2014, 159(1): 188-199.
RAP(RNA Antisense Purification)通过生物素标记的反义寡核苷酸探针来捕获其杂交的靶RNA,纯化后即可得到内源RNA及与之相结合的蛋白及核酸,这是研究RNA与DNA,RNA与蛋白,RNA与RNA相互作用的一种新方法。将RAP与测序或质谱技术结合,可以研究RNA与染色质的互作,鉴定与RNA相互作用的蛋白,在转录组层面上研究多种RNA间的转录调控关系,因此RAP可作为转录调控分子机制研究的新武器。
 
为了帮助大家更详尽的了解RAP技术,晶能小编精心准备了2篇关于RAP技术的文章,以RAP技术的发展为主线,从技术介绍到案例分析,为您全方位解读RAP应用。
 
RAP起源:lncRNA-染色质的相互作用
 
哺乳动物基因组编码数千种长链非编码RNA(lncRNA),这些lncRNA在细胞中有着重要的生物学功能。研究表明lncRNA可以通过识别基因组靶位点,与染色质发生相互作用来调控基因的表达,但机制尚不清楚。为此,加州理工学院Guttman博士团队开发出了一项新技术来研究lncRNA与染色质的相互作用。该技术即为RAP(RNA Antisense Purification),是一种应用生物素标记的反义寡核苷酸捕获目标RNA,从而研究与特定的RNA相互作用的DNA的技术。其主要技术流程如下: a. 针对目标RNA设计反义寡核苷酸探针,并合成探针;b. 细胞交联,溶解细胞,并打断DNA;c. 将生物素标记的探针与核酸复合物一起孵育;d. 洗脱、纯化之后,进行测序分析(图1)。
 
图1 RAP简要技术流程(Engreitz J M, Pandya-Jones A, McDonel P, et al.
 
2013年science[1]杂志上,Guttman团队首次提出了RAP技术,并将其成功应用于目前研究最广泛的lncRNA——Xist的研究。众所周知,Xist是参与X染色体沉默的一种lncRNA分子,虽然对其功能已经非常了解,但Xist沉默X染色体的分子机制尚不明确。在该研究中,Guttman团队首先论证了RAP技术的可行性,随后用该方法探究了Xist在X染色体失活过程中的基因组定位及其迁移方式。结果发现,Xist可以识别三维基因组结构,通过改变染色质的空间结构来逐步迁移,并沉默整条X染色体。Guttman说,RAP令人激动的地方不仅仅是解释了Xist的运作机制,而是RAP技术也普遍适用于其他lncRNA研究。 
 
RAP发展:lncRNA-蛋白质的相互作用
 
在将RAP技术应用于lncRNA与染色质的相互作用的研究之后,Guttman团队并没有停下研究的脚步,他们与Broad研究所合作在nature上[2]发文,表明RAP技术同样适用于研究RNA与蛋白质的相互作用。新研究仍是探究Xist的分子机制,但重点放在了参与X染色体沉默的蛋白。为了找到与Xist直接作用的蛋白,研究人员对RAP技术进行了改进,主要体现在两方面:交联和纯化方式。交联由原来的化学交联改成了紫外交联,紫外交联能使RNA与蛋白之间形成稳定的共价连接。而纯化的方式则改成了去除非共价连接的变性条件,以便保留与RNA形成共价连接的蛋白。纯化得到RNA复合物之后,用定量质谱分析法就可以获得与RNA相互作用的蛋白(图2)。根据新建立的RAP-MS技术,该研究发现SHARP蛋白会与Xist发生直接的相互作用,且通过招募SMRT,激活HDAC3,抑制RNA聚合酶II的结合等方式沉默基因表达。
 
图2 RNA-蛋白质互作技术流程(McHugh C A, Chen C K, Chow A, et al.
 
RAP延伸:RNA-RNA间的相互作用
 
随着转录调控研究的不断深入,RNA-RNA间的相互作用越来越受到重视,lncRNA、miRNA、circRNA及mRNA间可以通过ceRNA等相互作用机制调控生物体内复杂的生物学过程。RAP技术是否也可以应用于RNA-RNA间相互作用的研究呢?2014年发表于cell[3]的一篇文章论述了RAP技术在RNA间相互作用研究的应用。鉴于RNA间相互作用分为直接和间接作用两种,研究人员根据之前建立的RAP技术流程,开发出了三种新的实验流程:RAP-RNA[AMT], RAP-RNA[FA]和 RAP-RNA[FA-DSG]这三种方法的主要区别在于交联方法的不同(图3): RAP-RNA[AMT]用的是AMT(4’-aminomethyltrioxalen),一种补骨脂素衍生物交联剂,可以使RNA与RNA间通过尿苷产生交联,适用于直接的RNA-RNA相互作用。RAP-RNA[FA]用的交联剂是FA(formaldehyde),可以同时交联RNA-RNA和RNA-蛋白,因此适用于同时研究RNA间的直接和间接相互作用。而RAP-RNA[FA-DSG]在FA的基础上,又添加了DSG(disuccinimidyl glutarate),一种强蛋白交联剂,更适用于RNA间通过多个蛋白连接的情况。这三种方法覆盖了所有RNA间相互作用的情况,研究者可以根据其研究目的选择最合适的方法来应用。
 
图3 三种RAP-RNA方法的区别(Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al.
 
转录调控研究中,lncRNA-mRNA,miRNA-mRNA等通过序列互补直接结合的情况比较常见,因此RAP-RNA[AMT]的应用可能更为广泛。以U1 snRNA为例,RAP-RNA[AMT]的实验流程见图4,主要步骤为:a. 设计并合成生物素标记的探针;b. 用AMT交联细胞;C. 裂解细胞,消化蛋白和DNA,片段化RNA;d. 将探针与RNA杂交;e. 洗脱RNA复合物,纯化RNA后进行测序分析。在RAP-RNA实验之后,通过qRT-PCR和二代测序等技术,可以研究与目标RNA相互作用的RNA,探究更深层的转录调控机制。
 
晶能生物最新推出RAP-RNA整体研究方案,可与全转录组测序技术相结合,在转录水平上研究lncRNA-mRNA,miRNA-mRNA,circRNA-mRNA等RNA间的相互作用,探究参与重要生命活动的潜在调控网络,助力您发表高分文章。
 
图4 RAP-RNA[AMT]的实验流程(Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al.
 
下一期,小编将通过一个具体的案例来探究RAP在转录调控中的实际应用,该研究思路清晰、易于理解,可作为转录组相关研究课题设计的范本。敬请期待。
 
参考文献
[1] Engreitz J M, Pandya-Jones A, McDonel P, et al. The Xist lncRNA exploits three-dimensional genome architecture to spread across the X chromosome[J]. Science, 2013, 341(6147): 1237973.
[2] McHugh C A, Chen C K, Chow A, et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3[J]. Nature, 2015, 521(7551): 232-236.
[3] Engreitz J M, Sirokman K, McDonel P, et al. RNA-RNA interactions enable specific targeting of noncoding RNAs to nascent Pre-mRNAs and chromatin sites[J]. Cell, 2014, 159(1): 188-199.
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