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【外显子测序】TUBB8基因突变致人类卵子减数分裂阻滞
发布日期:2016-10-19浏览:

题目:Mutationsin TUBB8 and Human Oocyte Meiotic Arrest

杂志:New england journal of medicine         IF55.873

晶能工作:外显子测序 


文章导读

2016年1月21日,复旦大学生物医学研究院王磊教授及其团队在国际顶级医学杂志《新英格兰医学杂志》上阐述了导致人类卵母细胞成熟障碍的遗传机制( 本工作中的外显子测序工作由晶能生物完成)。王磊教授一直致力于利用分子遗传学手段寻找人类生殖疾病相关致病基因,并利用细胞、动物模型对相关基因功能展开深入的研究,在本次研究中,他利用遗传及功能基因组学手段揭开了人类卵子成熟障碍之谜。

 

摘要:

人类生殖繁衍主要依赖于成熟卵细胞和精子融合形成的受精卵,但是阻滞人卵细胞成熟的遗传机制至今未知。研究人员利用外显子组测序技术对不孕症患者四代家系中的5名成员进行研究,其中3名患者因卵母细胞第一次减数分裂受到抑制而导致不孕。接着对这5名患者及家系中的其他成员,加上另外23个患病家系的DNA样本,利用sanger测序检测候选基因TUBB8的突变情况。然后利用RT-PCR技术检测卵母细胞、早期胚胎、精子细胞和部分组织中的TUBB8和其他β-微管蛋白亚型的表达。α-微管蛋白多肽和β-微管蛋白多肽组装形成异二聚体,研究人员利用实验评估TUBB8突变是否影响体外异二聚体组装、HeLa细胞系中的微管结构、酵母细胞中的微管动力学以及小鼠和人类卵母细胞的纺锤体组装。

 

结果研究者在灵长类动物特有基因TUBB8中鉴定出7个突变。24个家系中,其中7个家系的卵母细胞第一次减数分裂阻滞是由该基因突变引起。TUBB8在卵母细胞和早期胚胎中特异表达,该基因编码几乎所有表达的微管蛋白。TUBB8发生突变影响依赖伴侣蛋白的折叠以及α/β-微管蛋白异二聚体组装过程,破坏了体外培养细胞的微管表达方式,改变了体内微管动力学,导致纺锤体组装过程出现严重缺陷,进而造成小鼠和人类卵母细胞的发育停滞。

 

最后研究者得出结论,TUBB8突变具有显性负效应,可破坏微管功能并影响卵母细胞减数分裂纺锤体组装过程及卵细胞的形成,从而导致女性不孕。

 

研究背景:

处于减数第二次分裂中期的卵母细胞与精子发生融合形成受精卵,人类的生殖繁衍真正开始。人卵母细胞进行减数分裂,在新生的卵巢中卵母细胞周期停滞于减数第一次分裂前期,直至青春期在促黄体激素的刺激下重新开始并进行排卵。卵母细胞停滞在减数第一次分裂前期含有完整的细胞核,被称为胚泡,在重新获得减数分裂的能力时胚泡破裂。胚泡破裂后,第一次减数分裂中期通过不对称分裂产生一个极体和一个卵细胞进入第二次减数分裂。成熟的卵母细胞停滞在第二次减数分裂的中期。对绝大多数的哺乳动物而言,这一阶段是能否成功受孕的关键。

 

体外受精(IVF)产生的婴儿占全世界新生儿的1~3%。在卵巢及人体绒毛膜促性腺激素的作用下,部分卵母细胞仍未发育成熟的临床病例普遍存在,但是卵母细胞全部不能发育为成熟卵细胞被报道的仅有很少几例,并且造成这种临床表型的遗传机制完全未知。

 

实验方法:

1. 研究对象:24个具有卵子成熟障碍的家系

2. 研究思路:

实验结果展示:

1. 研究人员对一个具有常染色体显性遗传模式的四代家系(家系1)进行研究(图1)。女性患者的配偶为正常健康男性。

图1   卵母细胞成熟受抑制的不孕患者中TUBB8变异情况及其家系图

 

2. 患者III-5试图进行体外受精,结果卵母细胞处于减数第一次分裂中期(表1),即使在体外培养也不能发育为成熟的卵细胞。

 表1    7个家系不孕患者中含有TUBB8突变卵母细胞的特征及临床特征

 

3. 对不孕患者III-4的3个处于减数第一次分裂中期和1个表型不正常的卵细胞注射精子,在显微镜下观察发现,没有一个卵细胞可形成纺锤体(图2A和2B)。全外显子测序分析家系1中的5位成员(3个患者和2个正常),结果鉴定出1个突变位点:TUBB8基因编码区杂合性错义突变c.T686C (p.V229A)。TUBB8基因编码灵长类动物特有的β-微管蛋白亚型。这一突变在家系1中的不孕女性中共分离并且表现为父系遗传模式(图1)。 

除此之外,研究人员还在7个临床表型相似的不孕患者中鉴定出TUBB8另外6个突变位点,具体信息如下:家系2中2位患者(c.G1249A,p.D417N);家系5中的1位患者(c.T1088C,p.M363T);家系6中的1位患者(c.G5A,p.R2K)以及家系7中一位患者(c.G900A,p.M300I),再加上家系3和4中的denovo突变(c.C527T,p.S176L和c.G785A,p.R262Q)(图1)。分别对家系1、2、3、4和6中不孕患者的处于减数第一次分裂中期的卵母细胞进行免疫染色,结果显示卵母细胞中的纺锤体要么为非正常状态,要么检测不到纺锤体存在(图2C)。因此,所有的不孕患者均不能生成成熟的处于减数第二次分裂中的卵母细胞。针对不同发育阶段的卵母细胞利用特异抗体进行免疫染色,结果证实TUBB8定位于纺锤体中。 

2  卵细胞成熟受抑制的表型

A 正常卵母细胞显微拍摄图黑色箭头标示第一极体,白色箭头标示纺锤体;B 家系1中不孕患者III-4的卵母细胞显微拍摄图观测不到正常纺锤体及第一极体;C正常卵母细胞及不孕患者的卵母细胞免疫染色图蓝色标示纺锤体,绿色标示DNA

 

        为了检测体内TUBB8突变对微管产生的影响,研究人员将FLAG标记的重组质粒转染HeLa细胞系。转染野生型TUBB8的细胞系中,可观察到组装正常的微管网络(图3A),而转染突变型TUBB8,不论是正常还是高水平表达,组装出的微管均呈现出不正常表型,并且会导致微管网络的整体缺失。这种缺失表型与预测的可能干扰异二聚体稳定性,β-微管蛋白折叠,或者聚合作用的突变(V229A,S176L,M363T,R2K和M300I)显著相关。微管组织结构变异表型则由干扰驱动蛋白结合相关的突变(R26Q2和D417N)引起(图3B)。

3  HeLa细胞系中TUBB8突变对微管组织产生影响

       细胞系中转染野生型及突变型TUBB8,然后进行免疫荧光染色 A 绿色为转染基因表达情况红色为内源性微管网络 B 对图A中的结果进行定量分析

    为了确立TUBB8突变和不孕表型之间的必然联系,研究人员将野生型和突变型的TUBB8 RNA显微注射小鼠卵母细胞。注射野生型TUBB8 RNA的卵母细胞,在胚泡破裂大约12h后形成正常的成熟卵母细胞,而注射任何一种突变的TUBB8 RNAs导致卵母细胞成熟受到抑制,并且形成畸形的纺锤体。同时,第一极体排除率显著降低(6-33% vs 61±2.2%)(图4A)。研究人员将显微注射的RNA浓度提高(1000ng/ul),结果显示,高浓度的突变型TUBB8RNA(S176L和 D417N)最终导致纺锤体严重甚至彻底受损(图4B):出现卵母细胞成熟障碍表型。为了进一步验证TUBB8这一突变效应,研究人员将TUBB8 S176L 和D417N突变型RNAs显微注射入人类胚泡期的卵母细胞,结果显示纺锤体的组装严重或者彻底受损(图4C)。与小鼠卵母细胞用相同方式处理,结果一致。

4  小鼠及人卵母细胞中表达突变型TUBB8 

       A 小鼠卵母细胞中注射TUBB8突变型RNA及野生型RNA后极体排除率比较; B 小鼠卵母细胞中注射突变及野生型TUBB8 胚泡破裂12h后免疫染色图; C人卵母细胞中注射突变及野生型TUBB8 胚泡破裂16h后免疫染色图 蓝色为染色体  绿色为纺锤体红色为TUBB8

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