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【RNA-seq】核糖体增强的单链Ago2加工的干扰RNA导致有效基因沉默,减少脱靶效应
发布日期:2016-10-19浏览:

晶能生物客户文章-核糖体增强的单链Ago2加工的干扰RNA导致有效基因沉默,减少脱靶效应,文章发表于杂志nature communications。

 

文章题目:Ribozyme-enhancedsingle-stranded Ago2-processed interfering RNA triggers efficient genesilencing with fewer off-target effects

杂志:nature communications        IF11.47

实验方法:Small RNA deep sequencing (Illumina HiSeq 2000)

  

研究背景

RNA干扰自从在秀丽隐杆线虫中发现后已经成为了强大的基因沉默工具,具有大的治疗潜力。RNA干扰是由小干扰RNA(siRNA)产生,siRNA是大约21nt的双链RNA,在其3’末端有一个2nt的突出部分。本文作者设计了一个新的siRNA前体,又叫单链Ago2加工的干扰RNA,是由一个16-18bp的茎及与靶基因互补的环构成,在其3’末端加上一个来自丁型肝炎病毒的核糖体,使这一siRNA沉默基因的能力增强,因此已成为新的RNA干扰的工具。

 

实验结果:

不同加工方式产生不同种类的shRNA

       为了系统地研究不同结构对shRNA(short-hairpin RNA)的影响,作者设计了一系列以EGFP为靶基因的shRNA,茎的长度范围在14-24,环的长度为4nt或7nt (Fig. 1a)。每一个shRNA被设计成茎环区尽可能与21nt靶序列互补的核苷酸序列。令人以外的是不同茎长的shRNA其沉默能力也显示出明显的双峰模式 (Fig. 1b)。第一个峰的茎长度范围是22-24bp,第二个是16-18bp。Northern blotting分析显示shRNA的加工模式可分为3类。茎长为22–24 bp的shRNA优先被加工成长度为21-24nt的siRNA,典型的Dicer酶切产品。相比之下,茎长16–18 bp的shRNAs 产生更多样化的siRNAs (<25 nt)及中间产物(长度>24nt)。茎长为 19–20 bp的shRNA只能产生一些中间产物(长度>30nt),没有进一步剪切成更短的siRNA。

        有趣的是茎长>21 bp的shRNA产生双链siRNA,而茎长<19 bp的shRNA只产生与5’链已知的siRNA(Fig. 1c,d)。将shRNA转染到敲除Ago2 的HEK293 细胞系中,结果靶基因没有被抑制,说明shRNA的加工或沉默能力依赖Ago2(Fig. 1e)。但是Northern blotting结果显示茎长>21nt的shRNA在不依赖Ago2也能被加工,而茎长<21nt的shRNA加工必须依赖Ago2(Fig. 1e)。

 

末端核糖体增强 saiRNA 和shRNA的活性

        为了提高saiRNA 和shRNA的活性,作者引入一个核糖体,可以在想要的位置进行自我剪切。丁型肝炎病毒(HDV)核糖体是非常合适的,因为它能精确地调节体外RNA自我剪切的位置,作者在saiGP 3’末端下游插入HDV核糖体(Fig. 2a)。伴随着体外转录,插入的HDV核糖体通过自我剪切有效地与RNA结合,从而产生了统一的3’突出部分(Fig.2b)。作者在哺乳动物表达载体中将HDV 核糖体与saiRNA 3’末端下游融合,使saiGP得沉默能力提高40%,与shRNA相比,其沉默活性更强(Fig. 2c,d)。Northern blotting 分析显示含有HDV核糖体的 saiGP产生更多的siGP及Ago2加工的中间产物,这表明saiRNA的稳定性或与Ago2 的联系增强了。另外加入HDV核糖体也提高了以人类LaminC为靶基因的saiRNA的抑制活性(Fig. 2e)。

 

saiRNA相对于shRNA导致更少的脱靶效应

        通过比较RNA干扰的上靶和脱靶效应,发现尽管两者对靶基因的抑制活性相似,但是saiRNA-RZ导致的脱靶效应显著小于shRNA (Fig. 4e)。脱靶效应被siRNA的guide strand(与靶基因互补的链)导致,而 passenger strand(与靶基因相同的链)可与非靶基因完全或部分结合。利用5’末端的热力学稳定性设计shRNA可减少passenger strand与RNA诱导的沉默复合体结合,但是不能完全消除这种影响(Fig. 4b,d)。被shRNA(靶基因EGFP,LaminC ,P53)的passenger strands导致的脱靶效应被检测出,而相应的saiRNA没有检测到脱靶效应(Fig. 4f)。作者还发现以正义mRNA为靶序列的shRNA,也能对反义的mRNA表达产生显著影响,而相应的 saiRNA却没有产生这种影响。

 

       为了全面分析脱靶效应对内源基因的影响,作者分别将等量的空白质粒(con), shGP(以EGFP为靶基因的短发夹状RNA), saiGP-RZ, shGP-LC (animproved shRNA design for generating a more accurate 5’end of the siRNA)转染到人类HEK293细胞系,结果发现与shGP- 或shGPLC-transfected cells相比,在saiRNA转染的HEK293 cells中下调倍数超过1.5的基因数量是更少的(Fig. 4g; Table 1)。超过一半的下调mRNA至少含有一个靶位点,在其3’UTR区与guide strand的2-7nt的种子序列互补 (Table 1; SupplementaryFig. 7b)。

 

        另外,有一部分下调的mRNA可与shGP 、shGP-LC的 passenger strand 靶向互补 (Table 1)。为了证实转录组测序结果,作者随机选择14个由于脱靶效应而显著下调的基因,利用RT-PCR检测表达量,发现与测序结果的表达量变化一致 (Supplementary Fig. 7e)。测序结果还发现saiGP-RZ 和shGP-LC的guide strands有同源的5’末端区域,而在shGP的guide strands 和passenger strands 5’末端具有高的异质性,导致脱靶效应(Fig. 5a; SupplementaryFig. 8a)。总之,saiRNA相对shRNA及其修饰模式来说很少引起脱靶效应。

Figure 5 | saiRNAexhibits less competition with endogenous miRNAs than does shRNA.(a) Processingof shGP, shGP-LC and saiGP-RZ analysed by deep sequencing. Small RNAs fromHEK293 cells transfected with plasmids encoding shGP, shGP-LC or saiGP-RZ weresubjected to deep-sequencinganalysis. The 5’and 3’ends of the two most abundantisoforms of the guide strand or passenger strand are labelled with red or blackarrows, respectively;relative abundance is indicated next to the arrows. Thenucleotides in blue indicate the sequence of the H1 promoter. The blue arrowindicates the HDV ribozyme cleavage site.

 

Supplementary  Figure 8.  saiRNA  exhibits less  competition  with endogenous  miRNA  than shRNA. (a) Processing of shLC, shLC-LC and saiLC-RZ analyzed  by deep  sequencing.  Small RNAs  from  HEK293 cells  transfected  with plasmids  encoding  shLC, shLC-LC  or  saiLC-RZ were  subjected  to deepsequencing analysis. The 5’and 3’end positions of the two most abundant isoforms of the guide strand orpassenger strand are labeled with red or black arrows, respectively,  with the  relative  abundance indicated  next  to the  arrows.  The nucleotides  in  blue indicate  the  sequence of  H1  promoter. The  blue  arrow indicates the  cleavage  site of  HDV  ribozyme.

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